血凝實驗操作報告

時間：2022-10-20 18:49:44 盛林報告我要投稿

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血凝實驗操作報告

　　在人們越來越注重自身素養的今天，需要使用報告的情況越來越多，報告具有成文事后性的特點。其實寫報告并沒有想象中那么難，下面是小編整理的血凝實驗操作報告，僅供參考，歡迎大家閱讀。

血凝實驗操作報告

　　血凝實驗操作報告篇1

　　禽流感血凝-血凝抑制試驗操作方法及注意事項

　　禽流感血凝和血凝抑制試驗可用于血清中抗體水平的監測，也可用于判斷未使用疫苗群體的感染狀態等。該試驗是目前世界衛生組織和國際動物健康組織進行全球流感監測所普遍采用的方法，而且因其具有經濟、快速、可靠、操作簡便、能夠處理大量的樣品，并能在短時間內報告禽流感抗體水平等優點，已經成為當前基層獸醫實驗室禽流感疫病監測和免疫抗體檢測中最為常用的方法。但因該試驗受人為操作影響較大，經常因操作不規范、不嚴謹等造成結果偏差大、重復性差等問題，現根據幾年來的工作經驗對該試驗過程中應注意的事項做一探討。

　　一、血凝試驗操作程序

　　1、取96孔90°V形酶標板，用微量移液器在第一至第五排的1~12孔每孔加25 μL PBS液。

　　2、吸取25 μL標準禽流感抗原加入到第一排第1孔中充分混勻。

　　3、從第1孔吸取25 μL混勻后的抗原液加到第2孔中，混勻后吸取25μL加入到第3孔中，依次進行倍比稀釋至第二排最后一孔即第24孔，最后棄去25 μL。第三排孔至第四排孔同上操作。

　　4、依次向第一至第五排孔的每孔中加入25 μL 1%的雞紅細胞懸液。

　　5、將酶標板置于微量振蕩器上振蕩10秒，室溫（20-25℃）靜置30 min觀察結果（如果環境溫度太高，可置4℃環境下）。

　　6、結果判定：將板作45°傾斜，觀察紅細胞是否呈淚滴狀流淌。以完全凝集（不流淌）的抗原或病毒最高稀釋倍數為1個血凝單位（HAU）

　　二、血凝抑制試驗操作程序

　　1、根據血凝試驗結果配制4HAU抗原。（即1HAU抗原除以4）

　　2、取96孔V形酶標板，用移液器在第1~12孔各加入25 μL PBS。

　　3、在第1孔加入25 μL被檢血清，充分混勻后移出25 μL加至第2孔，依次類推，倍比稀釋至第12孔，棄去25 μL。

　　4、按以上步驟加入陽性血清和陰性血清（各做兩份），作對照孔。

　　5、在第1~12孔各加入25 μL 4單位抗原，置于微量振蕩器上輕輕混勻，室溫20-25℃下靜置30 min。

　　6、每孔加入25 μL 1%的雞紅細胞懸液。置于微量振蕩器上輕輕混勻，室溫（20-25℃）靜置40 min后觀察結果，若環境溫度過高，可于4℃條件下進行，紅細胞將呈明顯的紐扣狀沉到孔底。

　　7、結果判定：只有陰性對照孔血清滴度不大于2 log2，陽性對照孔誤差不超過1個滴度，試驗結果才有效。將酶標板作45°傾斜，以完全抑制紅細胞凝集的最大稀釋倍數判為該血清的血凝抑制滴度。當被檢血清效價大于等于4log2，判為禽流感抗體陽性。

　　三、試驗過程中的注意事項

　　1樣品的保存及試驗前處理

　　1.1 采集的血液樣品應及時分離血清，最好分裝至離心管中，標記清楚，離心后吸出血清，對應編號冷藏送檢，并禁止運輸過程中劇烈震動。

　　1.2 一般情況下，在5天內檢測的樣品可放置在4℃的冰箱中冷藏，否則低溫冷凍保存。

　　1.3 在檢測前血清樣品應充分混勻，混勻時采用上下緩慢顛倒幾次的方法即可，切忌劇烈振蕩而引起產生氣泡及血清中蛋白變性。

　　1.4 對出現膠凍狀的血清樣品，可采用反復攪動幾下再離心的方法有助于緩解該狀態。膠狀物是含纖維蛋白和纖維蛋白原的血清，可能是由于放置時間不夠造成的血清未完全析出狀態。不建議直接吸取其中少量的清亮血清。

　　1.5 水禽等樣品為排除非特異性反應，還應相應進行滅能反應。具體操作方法：56℃水浴鍋30min或加等量10%雞紅細胞，輕搖后靜置30分鐘，離心，收集上清液即可。

　　2器材的選擇

　　2.1 酶標板的選擇：

　　建議使用96孔90°V型板進行試驗，通過反復試驗證明：90°V型板相對于110°板及130°板來講，具有紅細胞沉降速度快，產生的凝集圖像清晰、結果容易判定等優點。

　　2.2 移液槍的選擇及使用：

　　①單道、多道可調微量移液槍應選擇合適的量程，以便精確度的提高。

　　②使用時應采用一檔吸液二檔排液的方法。吸取液體時，槍頭要深入液下緩慢平穩吸液。加緩沖液時

　　應加在板孔底部。倍比稀釋血清時，應每孔至少反復吹吸6次，以便混合均勻，還應注意盡量避免產生泡沫引起混合不均。加抗原及紅細胞時應在板內液面上方加樣，以免交叉污染，影響試驗結果。

　　③加樣、倍比稀釋時應高度集中注意力，以免漏加、重復加樣等。

　　3試劑的保存及配置

　　3.1 禽流感血凝抑制試驗所用的抗原、陽性血清應嚴格按照說明書的要求進行保存和配置，試驗前應提前將其恢復至室內溫。抗原的保存溫度為-20℃，反復凍融會降低抗原的滴度，應避免反復凍融。

　　3.2 PH7.2、0.01mol/L的PBS液的制備

　　①應盡量現用現配

　　②每次使用前應測PH值，以免時間過長而導致PH值發生改變。

　　③由于PH試紙跨度范圍偏大，PH值不易準確介定，因此最好采用酸度計準確測量PH值，以提高試驗的精確度。

　　④全部試驗均采用同一種稀釋液。

　　3.3 1%紅細胞的制備

　　①為避免有些雞只的紅細胞有自凝現象，因此配制1%紅細胞懸液時應最好選擇采取2-3只SPF雞或未進行過任何免疫過的成年公雞血液。當然采血的前提條件是要按十分之一采血量比例在一次性注射器中加入抗凝劑，如肝素、枸椽酸鈉、檸檬酸鈉等。

　　②采血完畢后最好分裝至2ml容量的圓底離心管中，因為通過2ml與1.5ml兩種容量離心管相比較，放入1.5ml尖底離心管中的話，離心后，離心管底部紅細胞不易與加入的PBS液混勻，易沉積在管底部，達不到洗脫干凈的'目的。

　　③經2000~3000r/min，5~10min，棄去上液和紅細胞上層的白細胞薄膜，再加入十倍以上血量的PBS液，上下緩慢顛倒（切忌用力過大使紅細胞破裂），使其充分混勻，再離心棄去上清液，反復幾次直至上清液清亮透明為止。

　　④在加紅細胞過程中還須不斷輕搖以確保紅細胞均勻，使其每孔加入相同數量的紅細胞。

　　⑤制備好的紅細胞液如果放置后上清液變紅，說明有溶血，不可再使用。

　　3.4抗原液的配制

　　①先做血凝試驗測定效價，以抗原與紅細胞完全凝集的孔為1HUA抗原，配制4HUA抗原應往前推算兩孔，即除以4后的值。

　　②每次做試驗前，必須重新檢測禽流感抗原的血凝效價，以免效價發生改變而導致抗原稀釋倍數不準確，從而導致試驗結果不準確。

　　③為保證配制的抗原準確，還要進行抗原回滴試驗。具體方法：做二排抗原回滴，在兩排的第1~8孔各加25微升PBS，取4HAU抗原25微升加在兩排的第1、第2孔，混勻，從第2孔倍比稀釋至第4孔，棄去25微升，另一排同樣。從第2至第8孔補25微升PBS，以保持75微升總量不變，另一排同樣。兩排的第1至第8孔各加25微升1%紅細胞，震蕩10秒鐘。靜置30分鐘觀察結果。這樣在第1孔為4HAU抗原，第2孔為2HAU抗原，第3孔為1HAU抗原，第4孔為1/2HAU抗原，均為75微升總量，第5至第8孔為空白對照。如果抗原回滴試驗不成立，應相應調整抗原濃度直至回滴試驗成立。因為如果抗原濃度過高，則所測定的抗體效價水平偏低，如果抗原濃度過低，則所測定的效價偏高。所以不調整抗原濃度至實驗成立的話會對結果有很大影響。

　　4結果的判定

　　每次試驗必須設陽性及陰性（空白）對照血清，判別試驗是否成立。判讀結果時，將酶標板傾斜45°，以孔底沉淀的紅細胞流動性好，呈淚珠樣流淌，邊緣無凝集顆粒為凝集完全抑制。

　　5試驗器具的清洗

　　每次試驗完畢后，應將酶標板中液體甩凈，然后用自來水反復沖凈每個孔，再放入3%NaOH中4小時，清水反復沖凈，再放入3%Hcl中4小時，清水反復沖凈，再用蒸餾水反復沖洗幾次，甩干水份，入干燥箱中干燥備用。實驗用燒杯、加樣槽、量筒等也應充分洗凈、干燥。以免器具內有雜物、污物以及殘留物從而影響試驗結果。

　　四、小結

　　在進行禽流感血凝抑制試驗時，應充分考慮到各方面的影響因素，提供的檢測結果才會真實可靠，準確掌握禽類的免疫抗體水平，進而為科學防控禽流感提供理論依據。

　　血凝實驗操作報告篇2

　　一、原理

　　流感病毒顆粒表面的血凝素（HA）蛋白，具有識別并吸附于紅細胞表面受體的結構，HA試驗由此得名。HA蛋白的抗體與受體的特異性結合能夠干擾HA蛋白與紅細胞受體的結合從而出現抑制現象。

　　二、應用

　　該試驗是目前WHO進行全球流感監測所普遍采用的試驗方法。可用于流感病毒分離株HA亞型的鑒定，也可用來檢測禽血清中是否有與抗原亞型一致的感染或免疫抗體。

　　三、缺點

　　只有當抗原和抗體HA亞型相一致時才能出現HI現象，各亞型間無明顯交叉反應；除雞血清以外，用雞紅細胞檢測哺乳動物和水禽的血清時需要除去存在于血清中的非特異凝集素；需要在每次試驗時進行抗原標準化；需要正確判讀的技能。

　　四、試驗步驟

　　1 阿氏（Alsevers）液配制

　　稱量葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉0.8g、檸檬酸0.055g、氯化鈉0.42g，加蒸餾水至100mL，散熱溶解后調pH值至6.1，

　　69kPa 15min高壓滅菌，4℃保存備用。（3.8%枸櫞酸鈉（3.8g枸櫞酸鈉，100ml超純水），101 kPa,20min高壓滅菌，4℃保存備用,保存期1個月）。

　　2 10%和1%雞紅細胞液的制備

　　2.1采血

　　用注射器吸取阿氏液約1mL（3.8%枸櫞酸鈉），取至少2只SPF雞（如果沒有SPF雞，可用常規試驗證明體內無禽流感和新城疫抗體的雞），采血約2～4mL，與阿氏液混合（3.8%枸櫞酸鈉），放入裝10mL阿氏液（生理鹽水）的離心管中混勻。

　　2.2 洗滌雞紅細胞

　　將離心管中的`血液經1500～1800 r/min 離心8分鐘，棄上清液，沉淀物加入阿氏液（生理鹽水），輕輕混合，再經1500～1800 r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細胞上層的白細胞薄膜，再重復2次以上過程后，加入阿氏液20 mL（生理鹽水），輕輕混合成紅細胞懸液，4℃保存備用，不超過5天。

　　2.3 10%雞紅細胞懸液

　　取阿氏液保存不超過5天的紅細胞，在錐形刻度離心管中離心1500～1800 r/min 8分鐘，棄去上清液，準確觀察刻度離心管中紅細胞體積(mL)，加入9倍體積(mL)的生理鹽水，用吸管反復吹吸使生理鹽水與紅細胞混合均勻。（此步

　　可省略，直接配制1%紅細胞）

　　2.4 1%雞紅細胞液

　　取混合均勻的10%雞紅細胞懸液1 mL，加入9 mL生理鹽水，混合均勻即可。（根據檢測血清的數量，估算一下需要的1%雞紅細胞量，可按0.3ml/每份血清）

　　3 抗原血凝效價測定（HA試驗，微量法）

　　3.1 在微量反應板的1孔～12孔均加入25μl PBS（生理鹽水），換滴頭。

　　3.2吸取25μl抗原加入第l孔，混勻。

　　3.3從第1孔吸取25μl，病毒液加入第2孔，混勻后吸取25μl加入第3孔，如此進行倍比稀釋至第11孔，從第11孔吸取25μl棄之，換滴頭。

　　3.4每孔再加入25μl PBS（生理鹽水）。

　　3.5每孔均加入25μl 體積分數為1%雞紅細胞懸液（將雞紅細胞懸液充分搖勻后加入）。

　　3.6振蕩混勻，在室溫（20～25℃）下靜置40min后觀察結果（如果環境溫度太高，可置4℃環境下反應1小時）。對照孔紅細胞將呈明顯的鈕扣狀沉到孔底。