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流式細胞術在臨床醫學中的應用進展
流式細胞術在臨床醫學中的應用進展【1】
【摘要】 流式細胞術(FCM)是一種對單細胞快速定量分析的新技術,能夠快速分析單個細胞的多種特性，其既可以定性也可以定量，適于大量樣品的檢測。
隨著流式細胞分析技術與方法的日臻完善和臨床應用范圍不斷拓寬，幾乎臨床醫學各學科都涉及到流式細胞分析技術的應用，已逐漸成為推動臨床醫學發展的重要手段,本文就流式細胞術在臨床上的應用進展作一綜述。
【關鍵詞】流式細胞術;臨床;進展
流式細胞術(flowcytometry,FCM)是20世紀70年代發展起來的對單細胞定量分析的一種新技術。
它借鑒了熒光標記技術、激光技術、單抗技術和計算機技術,具有極高的檢測速度與統計精確性,而且從單一細胞可以測得多個參數,為生物醫學與臨床檢驗提供了全新視角和強有力手段[1]。
目前,隨著單克隆抗體技術的發展,流式細胞儀檢測技術已經廣泛使用在基礎研究和臨床實踐的各個方面,發揮著重要作用。
本文就其在臨床上的應用綜述如下。
1 流式細胞術在免疫學中的應用�
FCM可以進行淋巴細胞亞群分析,可同時檢測出一種或幾種淋巴細胞表面亞群分析,將不同的淋巴細胞亞群區分開來,并計算出它們相互間的比例。
通過對患者淋巴細胞各亞群數量的測定了解淋巴細胞的分化功能,鑒別新的淋巴細胞亞群。
更重要的是通過研究大多數疾病的特異性淋巴細胞亞群或某些細胞表面標志的存在、缺乏、過度表達等,對一些疾病,如免疫性疾病、感染性疾病、腫瘤等診斷、治療、免疫功能重建和器官移植監測等有重要的臨床意義。
如HIV主要侵襲CD4+T細胞而導致CD4淋巴細胞減少,CD4/CD8淋巴細胞比值下降,為艾滋病的診斷和治療提供依據[2]。
在其它免疫功能性疾病的診治方面如系統性紅斑狼瘡(SLE)患者的淋巴細胞變化可反映該病的活動情況和器官侵犯程度,伴有嚴重腎臟損害的SLE患者可出現低CD4+、高CD8+的現象[3]。
此外,FCM可以用來進行組織相容性抗原(HLA)群體分析;HLA-B27抗原陽性與強直性脊柱炎等一系列關節病有著不同程度的正相關。
FCM應用HLA-B27特異性單抗檢測抗原，其敏感性較傳統的微量細胞毒性實驗大大提高,同時多參數的熒光測定使我們能夠在特定的細胞亞群中分析HLA-B27[4-5],還可以利用FCM進行移植配型移植后免疫狀態監測。
2 流式細胞術在血液學中的應用�
血液系統腫瘤的診斷和治療 FCM通過對外周血細胞或骨髓細胞表面抗原和DNA的檢測分析，對白血病、淋巴瘤等各種血液病的診斷、預后判斷和治療起著舉足輕重的作用。
FCM采用各種抗血細胞表面分化抗原的單克隆抗體，借助于各種熒光染料測定一個細胞的多種參數，以正確地判斷出該細胞的屬性。
各種血細胞系統都具有其獨特的抗原，當形態學檢查難以區別時，免疫表型參數對各種急性白血病、淋巴瘤的診斷和鑒別診斷有決定性作用，其診斷的準確性可達到90%左右[5]。
微小殘留病變(MRD)是白血病復發的主要根源,FCM能在患者緩解期檢測是否有殘留病變細胞，及早發現后采取措施避免復發。
而且測定 DNA倍體和進行細胞周期分析對指導白血病化療也有一定作用，不同的白血病患者或同一患者在不 同病期白血病細胞增殖狀況不同，定期了解細胞增殖情況采取相應藥物可以提高療效。
急性白血病的多耐藥基因(MDR)也常用FCM檢測，FCM特有的敏感性和特異性，用于檢測二氨基苯茚酮 mRNA的表達產物 P糖蛋白(Pgp)及其活性(作為藥物的排出泵，降低細胞內藥物濃度)，可以更直接的反映耐藥程度。
陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)是一種造血干細胞克隆病,細胞 CD55、CD59抗原表達減低是該病的一個特點。
FCM采用熒光標記的單克隆抗體對血細胞 CD59的表達做定量分析，可以協助臨床做出診斷并判斷疾病的嚴重程度。
網織紅細胞計數是反映骨髓造血功能的重要指標。
FCM通過某些熒光染料(吖啶橙等)與紅細胞中 RNA結合，定量測定網織紅細胞中 RNA，得到網織紅細胞占成熟紅細胞的百分比。
有報道認為[6]FCM比目測法的精確度更高。
此外，FCM還可以測量出網織紅細胞的成熟度，對紅細胞增殖能力的判斷很有意義，為干細胞移植術后恢復的判斷、貧血的治療監測、腫瘤患者放、化療對骨髓的抑制狀況等提供了依據。
造血干/祖細胞計數造血干/祖細胞具有自我復制和多向分化潛能，是各種血細胞和免疫細胞的始祖。
造血干/祖細胞計數對造血干細胞移植意義重大。
CD34抗原是早期造血干/祖細胞的表面標志，應用 FCM分析、計數 CD34 細胞已成為造血干/祖細胞移植、造血重建的重要指標。
由于血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白的表達水平的高低來判斷,FCM測定血小板膜糖蛋白的表達情況可以診斷血小板膜糖蛋白異常所致疾病,這類疾病很少見但病因明確,主要是GpⅡb/Ⅲa或GpⅠb/Ⅸ/Ⅴ缺陷所致。
患者血小板膜GpⅡb/Ⅲa的缺乏,導致血小板聚集功能明顯低下,這就是常染色體隱性遺傳病-血小板無力癥。
而巨血小板綜合征是由于GpⅠb/Ⅸ/Ⅴ復合物數量或質量的缺陷導致的遺傳性出血性疾病。
FCM還可以通過單抗免疫熒光標記血小板膜糖蛋白監測血小板功能及活化情況,評價活化血小板程度在血栓性疾病和血栓前狀態發生發展中的作用,有利于血栓栓塞性疾病的診斷和治療,此外血小板活化時細胞內的鈣離子濃度是活化血小板監測的一項非免疫性指標,免疫性血小板減少性紫癜患者血漿中可產生血小板自身抗體,結合在血小板表面,稱為血小板相關抗體,檢測血小板表面或血清中的相關抗體,可用于該病的診斷及治療監測[7]。
3 流式細胞術在腫瘤學中的應用�
FCM在腫瘤學中的應用主要是利用DNA含量測定進行包括癌前病變及早期癌變的檢出、化療指導以及預后評估等工作,FCM可精確定量DNA含量,能對癌前病變的性質和發展趨勢做出判斷,有助于癌變的早期診斷[6]。
首先需要把實體瘤組織解聚、分散制備成單細胞懸液,用熒光染料(碘化吡啶P1)染色后對細胞的DNA含量進行分析,將不易區分的群體細胞分成三個亞群(G期、S期、G2期),DNA含量直接代表細胞的倍體狀態,非倍體細胞與腫瘤惡性程度有關。
DNA非整倍體細胞峰存在可為腫瘤診斷提供有力依據[6]。
腫瘤細胞DNA倍體分析對患者預后的判斷亦有重要作用。
異倍體腫瘤惡性病變的復發率、轉移率及死亡率均較高,而二倍體及近二倍體腫瘤的預后則較好。
FCM不僅可以對惡性腫瘤DNA含量進行分析,還可根據化療過程中腫瘤DNA分布直方圖的變化去評估療效,了解細胞動力學變化,對腫瘤化療具有重要的意義。
臨床醫師可以根據細胞周期各時相的分布情況,依據化療藥物對細胞動力學的干擾理論,設計最佳治療方案。
從DNA直方圖直接地看到腫瘤細胞的殺傷變化,及時選用有效的藥物對腫瘤細胞達到最大的殺傷效果。
4 流式細胞術在細胞凋亡和多藥耐藥基因中的應用�
細胞凋亡是機體生長發育、細胞分化和病理狀態中細胞死亡的過程,凋亡典型的形態特征是核染色質固縮并分離,細胞質濃縮,細胞膜和核膜皺曲,核斷裂形成片斷,最后形成數量不等的凋亡小體。
FCM可以進行DNA含量分析,通過二倍體細胞G0/G1期峰前的亞二倍體峰來確定。
在凋亡早期,一些與膜通透性改變及凋亡有關的蛋白在細胞膜表面有特定表達。
通過FCM結合單克隆抗體可以檢測表達這些蛋白的細胞,從而確定細胞的凋亡情況。
多重耐藥性(multidrugresistance,MDR)是由多藥耐藥基因編碼的P糖蛋白(P-gp)親脂化合物,包括多種抗癌藥物和熒光染料的跨膜性排出泵。
從人淋巴細胞排除熒光染料與細胞內P-gp的含量直接相關。
當淋巴細胞出現MDR陽性細胞時,患者對化療藥物開始出現耐藥性,需要考慮其它治療方式。
多藥耐藥是腫瘤患者化療失敗的主要原因,FCM對多藥耐藥基因(如P170)和凋亡抑制基因及凋亡活化基因表達的測定,可為臨床治療效果分析提供有力依據[8]。
5 流式細胞術在器官移植中的應用�
FCM在器官移植中占有重要地位,可被用來判斷供者與受者之間是否合適,用來鑒別和定型同種異體反應抗體[6]。
通過供者白細胞和受者的血清共同孵育,如果受者血清中存在針對供者的循環抗體,就會同供者的淋巴細胞結合,再加入熒光素標記的二抗來顯示這種結合,此方法能在移植手術前發現高風險的受體。
移植后免疫表型的監測也很重要。
FCM可用于檢測移植后血液或移植內免疫成分的變化,以預防移植后免疫�
排斥反應,細胞免疫抑制治療效果和移植存活情況,可敏感地預測排斥反應的發生,為臨床治療提供有效依據。
6 流式細胞術在臨床細菌學中的應用�
流式細胞術在臨床細菌學中的應用具有快捷、靈敏,能同時進行多參數分析等優點,可廣泛用于細菌、病原體、毒素和血清抗體及藥敏試驗。
免疫熒光檢測方法中的流式微球分析(CBA)是FCM的一個新應用。
這種方法也可用于真菌、寄生蟲、病毒以及這些病原體的混合感染的檢測。
近年來,FCM與熒光染料的聯合運用可判斷細菌的活力和功能狀態,由于速度快,該方法已被建議作為臨床實驗室的常規藥敏試驗。
FCM藥敏檢測方法較多,通過測量加入藥物孵育后的散射光的DNA含量來判斷抗生素對細菌的敏感性。
該法現被認為是FCM在該領域應用的經典方法[6]。
7 FCM在細胞生物學中的應用�
在細胞周期內,DNA含量隨時相發生周期性的變化,通過熒光探針對細胞進行相對DNA含量測定,可分析細胞周期各時相細胞的百分比,周期動力學參數以及DNA異倍體。
可利用與鈣離子特異結合的熒光染料和激發光譜或發射光譜是pH值依賴熒光染料進行細胞內鈣離子濃度測定和細胞內pH值測定[9]。
8 流式細胞術在優生遺傳領域中的應用�
流式細胞術可使含量極微的胎兒有核紅細胞得到富集,因為有核紅細胞含有胎兒的全部基因,并具有不影響多胎妊娠等優點,結合FISH,PCR等技術,使之具有應用于無創性產前診斷的廣闊前景[10]。
參考文獻
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流式細胞術在臨床檢驗中的應用【2】
摘要 目的：通過了解和討論，對流式細胞術在臨床檢驗中的應用情況做出詳細分析。
方法：通過多次嚴謹性實驗并且真實詳細記錄每次實驗數據，進一步分析流式細胞術在臨床檢驗中的應用效果和可行性。
結果：經過實驗數據分析，流式細胞術在檢驗HLA-B27抗原、淋巴細胞亞群、腫瘤標志物、白血病免疫、臨床微生物等應用中有著明顯的效果。
結論：流式細胞術在臨床檢驗中可以得到很好的應用。
關鍵詞 流式細胞術;流式細胞儀;臨床檢驗;應用
流式細胞術是一種生物學技術，用流式細胞儀(FACS)對懸浮于流體中的微小顆粒進行計數和分選。
這種技術可以用來對流過光學或電子檢測器的一個個細胞進行連續的多種參數分析。
流式細胞術(FCM)是對懸液中的單細胞或其他生物粒子，通過檢測標記的熒光信號，實現高速、逐一的細胞定量分析和分選的技術。
FCM不但快速、靈敏而且還可以同時對多個參數進行分析，FCM在臨床微生物檢測中的作用受到越來越多人的關注。
FCM不但可以用來檢測受染細胞內的病毒抗原，而且還可以對受染細胞表面的病毒抗原進行檢測。
由于FCM檢測的一般只是單個細胞，因此經過FCM檢測的受染細胞只適用于支氣管灌洗液、血液、尿標本以及一些經酶消化過的組織細胞，同時由于FCM進行的是多參數分析。
所以FCM體外抗生素藥敏試驗的主要機制是，通過FCM檢測病原體和染料結合在一起后所發出的不同強度的熒光。
從而間接地反映出病原體的功能狀態以及活性，以達到幫助判斷病原體對抗生素的反應性目的，其中用于研究抗菌效應的熒光染料主要有2大類：其中用來標記DNA和RNA的染料主要包括如溴化乙錠、碘化丙啶等;其次是用來反映代謝活性或結合蛋白的探針，其中包括異硫氰酸熒光素、膜電位敏感性染料等。
怎樣選擇這些物質，與這種染料本身的發射特性有關，同時抗生素的作用機制也可能關系到這些物質的選擇。
近年來FCM在細菌的藥敏效應的研究領域已獲成功，將這些熒光染料和FCM聯合運用到一起，可以判斷其細菌活力與功能狀態，這種方法由于有速度快等優勢，臨床實驗室的常規藥敏試驗中也應用到這種方法。
方法
本實驗用到的細胞定量分析和分選技術，這個技術要用的實驗細胞包括MCF7、293(T)、U20S等。
以U20S細胞為例，他們通常所用的操作方法：首先對細胞進行培養以及鋪板，轉染、細胞分板、上機樣本制備、加藥刺激、細胞收獲及處理、相關試劑配制等步驟。
其中在細胞培養時，以U20S細胞作為細胞株和材料，在這個過程我們要注意的是一瓶細胞總數一般情況下會達到1×107個。
在鋪板的過程首先要對細胞進行分化，然后才對細胞進行計數，計數時如果發現細胞密度很大，影響計數，就必須對細胞進行合適倍數的稀釋后才計數。
最后才能進行鋪板。
鋪板的過程是：首先在6cm培養皿按照每孔6×105個的數量加入細胞，然后將6cm培養皿沿水平面方向前后左右來回晃動，使細胞能夠均勻分布，晃動時要小心以防止培養液潑出，再將細胞放置培養箱里生長。
將這些過程都完成后，然后可以用轉染色劑Lipofectamin2000進行轉染操作，其操作過程：首先在DEF-FN載體上構建目的基因質粒，當細胞密度為達到50%～60%時，再進行轉染操作，轉染12～16h后，再根據細胞密度按1：3進行分板，使分板后細胞密度30%左右。
除了以轉染質粒作為陽性對照外，我們還可以以藥物處理細胞作為陽性對照。
將細胞鋪板24h后，再加藥對其進行刺激，加藥培養24h后，然后就可以對細胞進行收獲處理了。
注意在這個過程中要分別對培養液進行收集，在每個6cm規格的板中加入1mL胰酶進行消化。
待消化完畢后，再向內一一對應地加入已收集的培養液來中和胰酶。
上述過程進行完之后，最少要放置4h，才能從將細胞樣本從冰箱里取出進行離心操作來收集細胞。
將1×PBS清洗2遍后，再加入100μL 1×PBS將兩者混勻，加入10μL PI(終濃度100μg/mL)，10μLRnase(終濃度50μg/mL)，置于37℃水浴鍋，避光處理30min。
這樣才算完成上機樣本制備。
在處理分選細胞樣本前，要對細胞進行貼壁培養，每個細胞樣本至少需要1個10cm規格的細胞板，去除培養液酶消化，在37℃條件下充分消化至細胞輕拍脫壁，再加入5mL培養液進行中和，以充分分散細胞，取100μL細胞上機，測定轉染效率，剩余細胞計數、離心，根據轉染效率，分選模式，調節細胞濃度，達到上樣速率1000～3000個/s。
結果
經過實驗分析得出結果，將其用于病毒檢測具有以下優點及可行性：可在單個細胞中同時獲得多個分析參數;能定量檢出受染細胞，當用不同熒光染料標記不同的病毒抗原特異性抗體或將特異性病毒抗體與不同大小的乳膠顆粒相聯時，FCM可同時檢測到同一樣本中的多種病毒或病毒抗原，這種方法也可用于真菌、寄生蟲、病毒以及這些病原體混合感染的檢測。
討論
隨著科學技術的發展，流式細胞技術也取得了快速的發展，其臨床應用越來越廣泛，在臨床工作中發揮著重要的作用。
流式細胞術已普遍應用于免疫學、細胞生物學、生物化學等臨床醫學和基礎醫學研究領域。
隨著對FCM研究的日益深入，其價值已經從科學研究走人了臨床應用階段，在我國臨床醫學領域里已有著廣泛的應用。
可見流式細胞術在臨床檢驗的應用具有很好的發展前景和可靠性。
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