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固態納米孔分析檢測技術在分析化學中的應用論文范文
摘要：納米孔檢測技術以其獨特的優勢在電分析化學領域引起廣泛的關注， 基于此構建的電化學傳感器及電化學整流開關已被用于多種目標物分析， 如單分子蛋白檢測及DNA測序。納米孔既可由生物分子制成， 也可由固態材料制備。其中， 固態納米孔易于修飾， 機械性能、穩定性等相對較好， 應用較為廣泛。納米孔檢測技術主要的輸出信號為電阻脈沖和電流-電壓曲線 （離子整流） , 本文以兩種輸出信號為重點， 詳細介紹了納米孔檢測的原理和應用， 總結了近年來固態單納米孔通道在分析化學領域的發展， 并對該領域未來的發展趨勢和應用前景進行了展望。
關鍵詞：固態單納米孔； 電阻脈沖； 離子整流； 傳感器； 響應開關； 評述；
Application of Single Solid State Nanopore/Nanochannel Based on Polymer Membrane and Glass Nanopipette in Analytical Chemistry
Abstract:Nanopore/nanochannel sensing technique drawing more attention in analytical chemistry due to its unique advantages and the fabricated electrochemical sensors and electrochemical responsive gates have been widely used for more target detection, including single molecule protein and DNA sequencing. Nanopore/nanochannel that used for fabricating electrochemical detection system is mainly divided into biological nanopore and solid state nanopore, and among them, solid state nanopore/nanochannel has a wide range of application due to its inherent properties, such as easy for modification, good mechanical property and stability. Resistive pulse sensing and current-voltage curves （ ion current rectification） are two main methods of nanopore/nanochannel sensing technique used for target analysis, so in this review, we introduced the fundamentals and applications of nanopore sensing technique based on the above two methods. In addition, we concluded the application and development of single state nanopore/nanochannel in recent years, and also gave a brief look at the future challenges and prospects in the development of this field.
Keyword:Single solid nanopore/nanochannel; Resistive pulse; Ion current rectification; Sensor, Responsive gate; Review;
1、引言
生物醫學的快速發展和實際需求為生物傳感分析提出了新挑戰， 疾病早期診斷及復雜生物樣品中的靈敏、準確檢測的迫切要求促進分析化學傳感技術由傳統的定性與定量分析向更高的單分子水平檢測發展。自庫爾特計數器發明以來， 隨著單通道電流的記錄技術及納米微加工技術的日趨成熟， 納米孔檢測技術以其獨特的優勢， 如低成本、操作簡單快速、高通量、實時在線、免標記等， 已在分析化學領域獲得廣泛的關注和發展[1~3].基于納米孔構建的電化學傳感器已被廣泛用于檢測各種離子、生物分子、單分子蛋白及DNA, 并有望成為第四代DNA測序的新技術[4,5].
目前， 基于納米孔構建的電化學檢測系統主要分為三類：蛋白質納米孔、固態納米孔及結合兩者優勢構建的雜化納米孔。蛋白質納米孔包括α-溶血毒素 （α-HL） 、恥垢分枝桿菌毒素蛋白A （Msp A） 、噬菌體phi29連接器馬達蛋白 （Phi29 connector） 等， 蛋白質納米孔的孔徑精確、固定， 相關文獻報道展示了其在區分短的寡核苷酸片段及單鏈DNA方面的絕對優勢[6,7].但是， 蛋白質納米孔本身所具有的局限性， 如機械穩定性差、對實驗條件 （溫度、p H值、鹽濃度等） 要求苛刻， 限制了其廣泛應用[8~10].相對于蛋白質納米孔， 以人工材料構筑的固態納米孔， 包括氮化硅、氧化硅、石墨烯以及有機高分子薄膜[11], 具備較好的機械強度、優異的化學穩定性和熱穩定性， 能夠適應更加復雜的檢測環境， 還可重復使用， 節約成本[12].固態納米孔的形狀和尺寸可調控， 且能在其表面進行靈活的化學或生物修飾， 能夠用于多種復雜結構分子目標物的檢測。此外， 其穩定的結構有助于與其它微型探測器和探針或分析電路相集成， 構建更加靈敏的單分子檢測的生物傳感器[12,13].此外， 雜化納米孔的發展實現了生物孔和固態孔更好的優勢結合， 且避免了兩者的缺點， 對于單分子目標物的分析檢測具有更大優勢[14].目前開發的雜化納米孔主要有α-HL與Si Nx雜化的納米孔[15], 將碳納米管嵌入磷脂雙分子層或者細胞膜構建的雜化孔[16].隨著DNA折紙技術的發展， 三維DNA折紙結構與固態納米孔相結合構建的雜化納米孔已見諸報道[17].
本文結合固態納米孔的獨特優勢和性能， 總結了固態納米孔檢測的原理及在分析化學領域的應用， 分別介紹了以電阻脈沖作為輸出信號的固態納米孔用于檢測單分子DNA、蛋白質及提高檢測性能的方法， 對固態納米孔以離子整流作為輸出信號用于響應開關及電化學傳感器的構建進行了概述。
2、 電阻脈沖檢測方法
電阻脈沖檢測方法具有原理簡單、可實時在線監測及響應信號靈敏等優勢， 且電流信號經膜片鉗系統檢測、放大和轉換后， 易于讀取和分析， 是目前納米孔分析技術最常用的檢測手段[11,18].其工作原理如圖1所示， 在納米通道兩段施加恒電位， 在電場作用下， 電解質溶液中的離子流經通道， 產生穩定恒電流 （圖1A） .當電解質溶液中存在待測物時， 待測物質能夠在擴散作用和電壓驅動下進入納米孔， 堵塞納米通道， 導致電流降低 （圖1B） .當檢測物完全離開孔道時， 通道中的電解質狀態還原， 電流恢復初始值， 相應的會出現一個電阻的脈沖峰 （圖1C） .通過分析脈沖電阻圖可以得到3個重要信息：阻塞脈沖電流、分析物滯留時間及阻塞脈沖頻率。通過對以上數據進行綜合分析即可實現對檢測物的定性和定量檢測[19].單個分子/納米顆粒造成納米孔道尖端離子流的增強或減弱均會產生顯著的離子流擾動信號， 可用于獲得待測物的結構、長度、表面電荷、振動動頻率等信息。
目前， 基于該原理的檢測方法常被用于單分子DNA的傳感分析， 其對納米孔的尺寸要求比較嚴格， 納米孔的尺寸應盡量與目標檢測物在溶液相中的動態尺寸相匹配， 納米孔的尺寸過大或過小均不能產生理想的電阻脈沖信號[22,23].另外， 目標檢測物在電壓的驅動作用下穿過納米孔的速度非常快， 以目前的檢測手段及儀器的精度和時間分辨率， 對于實現單分子水平的檢測仍然存在挑戰， 尤其是對DNA測序過程中單個核苷酸的分辨識別[8,14].通常可通過增加溶液的鹽濃度、降低所施加的驅動電壓或縮小納米孔的尺寸， 以降低目標物穿孔的速度， 增強信噪比[24].例如， Xu等[25]開發了一種簡單有效的縮小玻璃管納米孔的尺寸的濕化學方法 （圖2A） , 通過硅酸鹽的水解反應在納米孔內壁形成Si O2層， 納米孔的尺寸縮小到<10 nm.該方法簡單有效， 低消耗， 對環境友好， 并且不改變玻璃管納米孔本身的特性。尺寸縮小之后的納米孔不僅降低了DNA的遷移速率， 而且顯著增強了DNA的遷移信號和信噪比。另外， 很多文獻報道已經證實， 在納米孔表面進行適當的功能化修飾， 不僅能夠有效降低納米孔對目標檢測物的非特異性吸附， 防止孔道堵塞， 降低背景信號， 也能夠縮小納米孔徑提高檢測效果[24].其原理主要依賴納米孔表面功能化修飾的官能團能夠對目標檢測物產生相互吸引力 （如氫鍵、范德華相互作用等） , 降低目標物的穿孔速度。Crick等[26]在玻璃管納米孔表面覆蓋多層石墨烯， 將納米孔完全覆蓋， 通過原位電化學刻蝕， 納米孔由完全閉合轉化為完全打開的狀態， 從而精確地制備具有任何孔徑尺寸的納米孔 （圖2B） .在較小孔徑尺寸下， 能夠有效降低DNA穿孔速率， 提高檢測效果。此外， 石墨烯表面具有較多的含氧基團， 不僅對DNA遷移速率起調節效果， 而且為納米孔表面的功能化提供了良好平臺。
盡管在納米孔內表面進行功能化和縮小納米孔的尺寸在降低目標物穿孔速度、提高選擇性和靈敏性方面展現出了一定的優勢， 但是這些策略通常需要細致、繁瑣的優化過程。開發易于制作和功能化的免標記生物傳感器， 實現對單分子目標物 （如核酸DNA和蛋白質） 的檢測仍然存在挑戰。最近的研究表明， 在固態納米孔道內嵌入一個門電極， 提供一個局部的電場， 可通過調控門電極的電壓實現對目標檢測物通過納米孔的速度及遷移方向的有效控制[27,28].此外， 研究人員還將場效應晶體管 （FET） 與納米孔相結合， 制備出具有離子效應的場效應管， 其物理原理與傳統的半導體場效應管相似， 即通過柵極控制離子的流速， 而非電子或者空穴。該傳感平臺在提高選擇性和控制目標物運輸方面具有潛在優勢。例如， Ren等[29]通過在具有雙孔的玻璃管納米孔的一個孔道內填充碳， 形成碳納米電極， 然后在玻璃管納米孔表面沉積一層聚吡咯導電層作為門電極， 構建了一個新的納米孔擴展的場效應晶體管 （nex FET） .如圖3A所示， 通過控制門電壓， 可有效控制DNA在單分子水平上通過納米孔道， 實現對其檢測。另外， 聚吡咯柵層適合嵌入可用于選擇性分子傳感的人工受體， 通過將胰島素嵌入到聚吡咯導電層， 實現了對抗胰島素人類免疫球蛋白抗體的檢測。nex FET的顯著優勢是能實時調整納米孔的離子運輸特點， 通過電聚合調整納米孔的尺寸與分析物相吻合， 在實現高通量檢測的同時也可顯著增強信噪比。除此之外， 該課題組同樣基于兩個孔道的玻璃管納米孔， 通過在其底部滴加一滴液滴形成納米橋梁， 將核酸DNA分子的轉移限制在間隔為20 nm的兩個納米孔之間 （圖3B） [30].相對于傳統的納米孔檢測方法而言， 該方法使目標分子的移動速率能夠降低約3個數量級， 有效增強了對目標物檢測的信噪比、分辨率、靈敏度， 降低了檢測限；同時， 該方法具有普適性， 可以擴展用于雙鏈DNA、RNA、單鏈DNA及蛋白質分子的檢測。
最近， 研究人員開始將納米孔作為一種確定蛋白物理參數的強有力的分析工具， 如蛋白的尺寸、構象狀態、蛋白與蛋白之間的相互作用及與適配體和抗體作用的動力學等[31~33].但是， 相對于DNA而言， 蛋白種確定蛋白物理參數的強有力的分析工具， 如蛋白的尺寸、構象狀態、蛋白與蛋白之間的相互作用及與適配體和抗體作用的動力學等[31~33].但是， 相對于DNA而言， 蛋白質具有不同的尺寸、三維結構和不均勻種確定蛋白物理參數的強有力的分析工具， 如蛋白的尺寸、構象狀態、蛋白與蛋白之間的相互作用及與適配體和抗體作用的動力學等[31~33].但是， 相對于DNA而言， 蛋白質具有不同的尺寸、三維結構和不均勻的電荷分布， 這些都對納米孔技術檢測蛋白質提出了挑戰， 尤其是對相似尺寸的蛋白質檢測的弊端就是缺乏選擇性。解決以上問題主要有兩種方法， 第一種方法是在納米孔表面修飾特異性的識別受體， 蛋白質與受體特異性結合阻塞納米孔[34,35];另一種方法是利用DNA作為載體分子分離和檢測蛋白[33,36].Bell等[37]通過DNA雜交將190個寡核苷酸 （約7.2 kbp） 組裝形成線性的雙鏈DNA作為載體， 在特定位置設置與目標蛋白質結合的特異性結合位點， 從而實現了對鏈霉親和素的檢測。首先， 將親和素負載在雙鏈DNA載體上， 其中， 1B、3B和5B分別對應著負載了1個、3個和5個親和素位點， 鏈霉親和素通過特異性結合作用連接到DNA載體上。將DNA載體置于納米孔檢測系統中， 在電壓的驅動作用下， DNA載體和蛋白的復合物進入納米孔道。由于結合的蛋白質分子位于DNA載體的中心位置， 所以在離子電流軌跡中， 蛋白質的特征電流峰信號清晰地出現在DNA信號中間。另外， 隨著蛋白綁定位點數量增加， 蛋白信號的振幅增大。利用該納米孔傳感器實現了在混合體系中對目標蛋白的特異性靈敏檢測。最近， Lin等[38]采用溶菌酶適配體修飾的金納米粒子為分子載體， 在復雜體系下實現對溶菌酶的高選擇性檢測。相對于目標蛋白而言， 適配體修飾的金納米粒子的引入有效增大了復合物的尺寸， 降低了表面的電荷量， 削弱了目標蛋白與納米孔之間的相互作用， 顯著增強了目標蛋白穿孔頻率及信噪比。值得一提的是， 以上的檢測只能實現對單一目標蛋白分子的檢測。Bell等[39]基于載體-蛋白復合結構的檢測方法， 提出了一種數字編碼的納米結構， 實現了在復雜體系中對4種蛋白的同時檢測。在該工作中， 在DNA載體中引入了納米孔可識別的獨特的條形碼， 當該DNA納米結構通過固態納米孔檢測時， 含有3個結構單元的條形碼對其檢測的準確性可達到94%.選取4個條形碼， 在每個條形碼的特定位置修飾對4種目標抗體具有特異性結合的綁定位點， 將其用于混合體系中四種抗體蛋白的同時檢測， 很容易通過條形碼的明顯差異實現對4種抗體的檢測和區分。基于載體-蛋白的檢測方法對蛋白質的檢測和識別相對比較成熟和準確， 但是這種DNA載體的設計和合成通常比較復雜， 需要基因工程和DNA合成化學等。
除了用于單分子的DNA和蛋白質檢測外， 固態納米孔作為一種強大的分析工具在其它應用方面也展現出了絕對的優勢。Chen等[40]利用單個的玻璃管錐形納米孔作為一個模型系統模擬研究了單膜磷脂囊泡遷移的動力學， 囊泡依次動態通過納米孔， 可通過周期性出現的離子動態阻塞電流信號進行直觀的觀察。另外， 通過調控納米孔的尺寸、溶液p H值、囊泡濃度、施加的電壓及納米孔內表面的荷電性所引起的離子電流阻塞信號振幅和滯留時間的變化， 實現對單膜磷脂囊泡遷移行為的系統研究。該課題組還利用納米孔分析技術在完全均質的條件下實現了對單分子DNA組裝結構的表征[41].他們以DNA雜交鏈反應 （HCR） 和催化發卡組裝 （CHA） 反應為例， 基于納米孔分析技術的超靈敏特性， 實現了對所形成的DNA納米結構的表征。當形成的DNA串聯體通過納米孔時， 其在孔道內的滯留時間能夠提供所形成的DNA串聯體的精確的長度和折疊信息。與原子力顯微鏡分析技術相比， 納米孔分析技術可通過對其穿孔事件進行計數和分析實現對單個的串聯體信息的檢測；與凝膠電泳相比， 可通過電流降低的幅度和滯留時間實現對形成的DNA串聯體的大致長度和結構信息的表征， 其超靈敏的檢測性同樣可以揭示被凝膠電泳及其它分析方法所掩蓋的DNA串聯體的結構信息。另外， 該檢測方法在均一溶液中進行， 最大程度避免了由于孵化、探針標記、無限稀釋、電場強度等對DNA串聯體結構的損傷。該納米孔的分析技術同樣適用于具有更復雜結構DNA折疊行為的表征。
3、離子整流
離子整流效應是非對稱納米通道的一種獨特的性質， 其中， 伏安曲線 （I-V） 是其電化學測定結果的直觀表現， 即在兩側電解質溶液完全相同的情況下， 非對稱的納米通道在相同外加電場強度下所測得的電流值有明顯差別， 伏安曲線呈一條曲線。在這種情況下， 離子整流比為正負相同的輸入電壓下所得的兩個電流的比值[42,43].Siwy等[42,44]對離子整流現象進行了深入的研究， 并基于納米孔道小孔的尺寸 （接近雙電層） 及表面帶電荷的不對稱性分布， 提出了廣為接受的靜電刺齒模型， 對納米通道內離子整流現象進行了解釋。Jiang的課題組[45~47]基于親疏水特性界面的仿生納米通道在該領域也開展了一系列卓有成效的工作。自2008年Wang等[48]基于錐形納米孔的離子整流現象實現了對藥物分子的成功檢測以來， 離子整流現象作為一種信號輸出檢測方法被用于對目標探測物進行定性和定量研究[11, 49~51].本部分主要集中介紹了基于離子整流效應的固態納米孔在分析化學傳感領域的應用， 包括玻璃管納米孔和高分子聚合物納米孔。
3.1 玻璃管納米孔
玻璃管納米孔以離子整流作為信號輸出實現對目標物檢測的報道比較少， 其主要原因可能是在其表面不容易進行化學修飾。Chen等[52]基于玻璃管納米孔， 利用聚谷氨酸作為一種非孵化探針， 實現了對Cu2+的快速選擇性檢測。聚谷氨酸的等電點為3.22, 在中性溶液 （p H=7.0） 中帶負電荷， 所以在納米孔的兩端分別加入聚谷氨酸和Cu2+, 在電壓的驅動下， 分別向納米孔的小孔端移動靠近， 且二者在小孔端發生螯合反應， 形成的螯合物阻塞納米孔， 引起電流值降低。該傳感器對Cu2+具有良好的檢測效果， 通過調控p H值可再生利用， 具有潛在的應用價值。盡管該方法通過選擇不同的螯合劑可實現對其它目標金屬離子的檢測， 但是其應用仍然存在局限性。所以， 對納米孔表面進行特定修飾是解決這種局限性、減少非特異性吸附、提高檢測性能的重要策略。
最常用的修飾方法主要有靜電相互作用和共價鍵作用。Actis等[53]利用靜電作用將殼聚糖和聚丙烯酸修飾在玻璃管納米孔表面， Cu2+可與其發生螯合作用， 吸附在納米孔表面， 在中性p H環境下實現對Cu2+的免標記、快速、可逆的檢測。基于共價鍵的相互作用方法中， 最常用的方法就是利用硅氧烷化學反應將3-氨丙基三乙氧基硅烷 （APTES） 修飾在玻璃管納米孔表面， 引入氨基， 進而在氨基的基礎上進行下一步修飾反應。基于該修飾方法， 李耀群課題組通過將不同的特異識別功能的官能團通過硅烷化的氨基修飾在納米孔表面， 以離子整流為輸出信號， 構建了多種電化學傳感器， 實現了對葡萄糖[54]、蛋白質[55]等的檢測， 同時將具有特定響應信號的聚合物修飾到納米孔表面， 構建了對p H值、溫度等具有單響應或多響應的離子整流器件[56,57].
He等[58]開發了3種將金納米膜沉積在玻璃管納米孔的內表面可控策略， 為玻璃管納米孔的進一步修飾應用開辟了新路徑。第一種方法如圖4A所示， 通過層層組裝將聚乙烯亞胺 （PEI） 與葡萄糖氧化酶 （GOx） 通過靜電作用修飾到玻璃管納米孔內表面， GOx在O2存在情況下能夠催化氧化葡萄糖產生H2O2, 進而將HAu Cl4還原成Au0.在反應過程中， 與PEI的氨基相互作用的Au Cl4! （作為成核位點） 會優先在玻璃表面還原形成小的Au種子， 可作為催化劑快速生長成為金膜從而覆蓋在玻璃管表面。該課題組提出的另一種簡單有效的無酶的策略， 玻璃管內表面通過原位化學還原HAu Cl4制備一層超薄的金膜。將聚L-組氨酸修飾在納米孔的小端作為一個支架材料實現對Au Cl4!的負載， 在鹽酸羥胺還原下形成金納米成核的位點。該方法與上述基于酶反應的方法相比， 更加簡單， 整個過程可在2 h內完成[59].基于以上的研究基礎， 該課題組又提出了一種簡便、直接、快速且環境友好的一步光化學方法在玻璃管表面制備超薄的金膜[60], 如圖4B所示。在紫外燈的照射下， HAu Cl4和乙醇作為常規的化學試劑， 被用于在玻璃管納米孔的內表面緩慢生長超薄的金膜， 由于玻璃管內壁在反應溶液p H≈4.5的條件下帶負電荷， 玻璃表面均勻的帶負電荷的點或缺陷可作為光化學還原過程中的金納米成核的位點。該方法對其它帶有羥基的光化學試劑， 如乙二醇、乙醇和葡萄糖等也同樣起作用， 但反應速率不同。以上方法均實現了在納米孔表面構筑金納米薄膜， 為后續在納米孔表面進一步的修飾提供了更多的可能性， 擴大和推動了基于玻璃管納米孔構建生物傳感器的應用范圍。例如， 該課題組在構筑的金膜覆蓋的玻璃管納米孔表面修飾含有巰基的化合物， 如半胱氨酸、硫尿嘧啶等， 研究了其隨p H值變化的離子整流特性， 并以此為電化學輸出信號構建了生物傳感器實現對尿酸的檢測[53~55].基于上述3種在玻璃管納米孔內表面構筑金膜方法， Cao等[61]報道了一種簡單、綠色仿生礦化的方法， 利用牛血清蛋白 （BSA） 為還原劑和保護劑， 在納米孔內表面修飾了一層結構良好的金納米簇薄膜， 如圖4C所示。首先， 在玻璃管納米孔表面修飾一層帶正電的聚合物PEI, 然后通過靜電相互作用將BSA組裝在納米孔表面。在p H11.5的條件下， BSA能夠將Au?隔離和封裝在納米孔表面， 隨后利用其自身的氨基酸殘基將Au?原位逐步還原為金納米簇， 覆蓋在納米孔表面。無論是溶液狀態還是在成膜狀態， 在激發光照射下， BSA保護的金納米簇均能發射出很強的熒光， 且熒光強度在較寬的p H值范圍內及高鹽濃度下非常穩定， 所以可使用熒光顯微鏡對該方法制備的金膜覆蓋的納米孔修飾的成膜狀態進行表征。該方法的另外一個優勢是不需要對納米孔表面形成的金納米簇膜進行二次修飾， 即實現了合成-修飾一體化， 利用金納米簇覆蓋的納米孔表面BSA中離子化的羧基 （COO!） 與精氨酸中的胍基通過協同作用所形成的獨特的離子對， 實現了對手性氨基酸分子精氨酸的分離和檢測。
最近， 空間限域電化學引起研究者的廣泛關注。研究人員利用納米孔有限的空間實現了對個體生物分子的高通量電化學傳感。Long的課題組[62]提出并擴展了納米孔中電化學限制域效應的概念， 從納米孔和分析物之間的強相互作用、電子傳遞過程以及納米孔內的亞波長光3個方面對其進行了闡述， 并將其應用于開發新的基于納米孔的傳感機制。另外， 該課題組將“電化學過程”限域在單個納米孔道內， 通過“化學-電化學”制備的策略， 實現了在普通化學實驗室即可構建含有電活性尖端的無線限域納孔電極， 具有高時間分辨及高電流分辨能力[63~66].
3.2 高分子聚合物納米孔
基于高分子聚合物納米孔的離子整流電化學傳感器報道的相對較多， 其主要原因是納米孔的構筑可通過化學腐蝕實現， 簡單方便；另外， 可通過控制刻蝕時間和刻蝕的方法制備出不同形狀、尺寸可調的納米通道；最重要的是， 刻蝕后的納米孔表面含有豐富的裸露的化學基團， 易于后續的表面功能化， 為開發智能納米通道體系提供了良好的材料基礎[67~69].目前， 應用最多、研究最廣的高分子類聚合物納米孔為聚對苯二甲酸乙二醇酯 （PET） 材質， 通過NAOH刻蝕制備的PET納米孔表面含有丱H和丆OOH等活性基團， 將特定的識別單元分子修飾在納米通道表面可實現對多種目標物， 包括離子、生物分子、蛋白質及DNA的特異性靈敏檢測[43,70,71].
通常， 在p H≤3條件下， 刻蝕制備的PET錐形納米孔不會表現出或者表現出非常弱的離子整流現象， 主要是因為隨著緩沖溶液的p H值降低到羧基的p Ka值， 納米孔表面的電荷降低到零[69].本研究組的研究發現， 在p H≤3且離子強度較低的緩沖溶液中， PET錐形納米孔表現出與表面帶正電荷的納米孔同樣明顯的離子整流現象， 如圖5A所示， 原來帶負電荷的表面在p H≤3時表面表現出正電荷， 電流-電壓曲線發生反轉[72].進一步研究發現， 該現象的出現必須滿足3個條件， 即掃描電壓足夠大、溶液離子強度要適當、電解液的p H≤3.研究結果表明， 在p H≤3條件下， PET納米孔表面帶正電所引起的離子整流現象是由于納米孔表面的羧基或羥基的氫進一步質子化造成的。該研究結果豐富了納米孔技術的知識， 表明基于錐形納米通道構建的依賴于p H值變化的離子整流納米二極管無需對PET膜進行任何修飾即可實現。在隨后的研究中發現， 未修飾的PET納米孔表面的羧基和羥基對多種金屬離子表現出良好的螯合能力， 吸附在納米孔表面， 且能引起納米孔離子整流的變化， 該結果與文獻[73, 74]報道一致。基于該原理可實現對特定金屬離子的檢測， 選擇性是關鍵。在p H=8的條件下， 強的螯合劑EDTA對Cr3+的螯合能力比納米孔表面的羧基及羥基的螯合能力弱， 但是EDTA對其它干擾金屬離子的螯合能力強。因此， 將EDTA引入該納米孔檢測系統可實現對Cr3+的特異性靈敏檢測 （圖5B） .該方法避免了傳統的方法在納米孔表面的繁瑣的修飾過程， 更加簡單、方便， 且通過結合特定的螯合劑可實現對特定金屬離子的選擇性靈敏檢測[75].
基于納米孔表面的羧基或羥基進行特定的化學修飾構建電化學傳感器和離子整流器件是目前研究的主流趨勢。本課題組基于靜電相互作用， 將PEI及Zr4+通過層層自組裝修飾在PET納米孔的內表面， 通過特定的單鏈DNA及碳納米管， 實現對目標物的檢測[40,67].當目標物存在時， 其能與單鏈DNA相互作用， 使得單鏈DNA雜交形成雙鏈DNA.Zr4+對含有磷酸基團的化合物具有很強的親和力[76], 能夠結合DNA.所以， 在納米孔檢測系統中， DNA在電壓的驅動作用下能夠進入納米孔道內且吸附在內表面， 引起納米孔離子整流現象的改變， 從而實現對目標物的檢測。為降低目標物檢測的背景信號及消除由于單鏈DNA的吸附造成的影響， 在檢測過程中， 我們引入碳納米管來選擇性地吸附單鏈DNA.通過對捕獲探針DNA的設計， 引入富T的DNA單鏈及ATP的適配子， 實現了金屬離子Hg2+及生物分子ATP的檢測， 且檢測性能良好 （圖6A） [43,70].同樣， 通過靜電相互作用及層層自組裝， Wen等[77]將磺化杯芳烴修飾在PET納米孔表面， 實現了對乙酰膽堿的高靈敏檢測。另外， 利用EDC/NHS的偶聯反應， 將具有特定識別功能的化合物、生物分子 （DNA, 酶等） 修飾在納米孔的表面構建仿生的納米離子通道， 實現了對多種目標物， 如金屬離子、生物分子等的檢測。Jiang的課題組[45,78]將環糊精修飾在PET錐形納米孔表面實現了對手性生物分子組氨酸、色氨酸等的分離檢測。Lin等[79]刻蝕制備了沙漏型PET納米孔， 將GOx和辣根過氧化物酶 （HRP） 修飾在納米孔的表面， 實現了對葡萄糖的檢測 （圖7B） .葡萄糖被GOx氧化成葡萄糖酸和H2O2, H2O2進一步被HRP降解變為H2O和O2.在該反應過程中， HRP不僅能夠有效降解H2O2, 促進GOx對葡萄糖氧化產生更多的葡萄糖酸， 且降解H2O2產生的O2能滿足GOx催化葡萄糖反應對O2的需求。在整個反應過程中， 積累產生的葡萄糖酸使得納米孔周圍微環境的p H值降低。由于納米孔道對微環境的改變具有獨特的陽離子選擇性能和高的靈敏度， 通過監控離子電流信號， 所構建的納米孔傳感器對葡萄糖展現出了良好的響應性能。
基于高分子聚合物納米孔的離子整流效應同時也被用于蛋白質的檢測， Ensinger等[80~83]做了許多相關工作。他們將與蛋白質具有特異性識別作用的化合物或蛋白分子修飾在納米孔表面， 實現目標蛋白的特異性結合， 通過納米孔離子整流的變化對其檢測。例如， 他們基于糖類化合物與外源凝集素的特異性作用， 將HRP （含有甘露糖殘基） [80]和β-D-甘露糖苷[81]修飾在PET納米孔表面， 實現對伴刀豆蛋白A的特異性檢測。將溶菌酶的適配體修飾在PET納米孔表面， 通過溶菌酶與適配體的特異性生物結合作用實現對溶菌酶的檢測[82].另外， 除了傳統的配體-受體相互作用用于目標蛋白的檢外， 他們還將金屬螯合劑配體修飾在納米孔表面， 通過鐵離子輔助形成的復合物實現對乳鐵蛋白的特異性檢測[83].該方法可擴展用于構建其它的基于金屬離子親和的仿生納米孔檢測系統用于其它生物分子的特異結合和識別。隨后， 基于鎳與組氨酸的特異性結合能力， 將鎳-次氮基三乙酸 （Ni-NTA） 的復合物被修飾到納米孔表面用于組氨酸標記蛋白的識別和檢測[36].
除了傳感器的構建以外， 研究人員還將各種具有響應功能的高分子聚合物及分子修飾在納米孔表面， 用于構建刺激響應型的離子整流開關器件。目前已經開發出對電壓、離子、p H值、溫度、光、氣體等單響應或多響應的離子整流開關[84~87].本研究組以PET納米孔表面的羧基和羥基作為光活性的位點， 通過自引發的光嫁接和光聚合反應， 將對CO2和溫度雙重響應的聚甲基丙烯酸N, N-二甲氨基乙酯 （PDMAEMA） 修飾到錐形納米孔表面， 構建了對CO2和溫度具有雙重響應的納米孔離子整流開關[88].在溶液中充CO2氣體時， 納米孔表面修飾的聚合物的叔胺基團發生質子化， 納米孔表面帶正荷， 使得整流信號發生變化。另外， 該聚合物的低臨界溶液溫度 （LCST） 約為40℃， 溫度的刺激同樣使得該聚合物的構象發生變化。當溫度高于LCST時， 聚合物呈現折疊狀態；相反， 當溫度低于LCST時， 聚合物呈現舒展狀態。聚合物折疊和舒展狀態使得納米孔的孔徑發生變化， 從而引起離子整流的變化。
4、與雙極電極相結合的檢測方法
雙極電極是一個置于溶液中的電子導體， 不通過導線接觸， 在其兩端施加電壓時， 能夠同時具有陽極和陰極的作用。雙極電極具有結構簡單， 制作加工方便， 無需直接導線連接便可使雙極電極的兩極發生電化學氧化–還原反應等諸多優勢， 被廣泛應用于材料的合成及非對稱修飾、電化學傳感免疫分析等領域， 是電化學研究新的熱點方向[89,90].最近， 本課題組利用PET納米通道易于刻蝕制備、孔徑可調、絕緣性及機械性能良好等優勢， 在納米孔道沉積金納米棒制備了納米級封閉式雙極電極陣列， 以電化學發光作為信號輸出， 實現了對多種目標物的靈敏檢測[91], 如圖7A所示。該方法制備雙極電極簡單快速， 并且雙極電極尺寸可通過PET的刻蝕時間進行調控， 克服了傳統光刻蝕方法制備微米級或納米級雙極電極的局限性， 是納米孔通道應用的新途徑。Long的課題組[92]將銀層覆蓋在玻璃管納米孔內構建了一個無線的基于開放式雙極電極的納米孔傳感器， 實現了對Hg2+的檢測， 如圖7B所示。當施加驅動電壓時， 覆蓋的銀層作為雙極電極， 在雙極電極陽極銀被氧化變為銀離子， 在雙極電極的陰極， 氫離子被還原為氫氣。當檢測物Hg2+存在時， 其還原電勢比H+低， 能夠在雙極電極的陰極優先被還原， 使得產生的H2減少， 電流擾動變小。基于此可實現對Hg2+等還原電勢比H+低的檢測物的檢測。該工作利用納米孔尖端極化作用產生表面聚集負電荷納米氫氣泡， 從而產生管尖離子流增強信號。這一納米孔創新機制被進一步應用于單個細胞內NADH的選擇性測量[20].
5、總結與展望
納米孔分析檢測技術作為一個強有力的技術手段， 在解決分析化學的基本問題， 如提高檢測的靈敏度實現目標物單分子水平上的檢測、提高檢測的選擇性能、抗干擾能力以及高通量實時在線檢測等方面展現出了突出的優勢， 并取得了突破性的進展， 所構建的電化學傳感器被廣泛用于目標物的定性及定量分析。實現在單分子水平上理解分子結構和功能以及實時生物分析是分析化學發展的重要方向， 納米孔分析技術以其獨特的性能在該領域展現出了卓越的優勢。近年來， 科研人員對固態納米孔在分析化學領域的應用進行了深入的研究并取得了顯著的成果， 包括以電阻脈沖作為輸出信號的單分子檢測、以離子整流信號為輸出構建的電化學傳感器及響應器件的構建， 并且基于納米孔的第四代DNA測序儀已經問世。但是， 仍然有很多關鍵性的問題亟待解決， 例如固態納米孔制備的重現性問題， 固態納米孔表面的可控修飾問題， 將納米孔檢測技術與其它技術手段 （如表面增強拉曼、石英晶體微天平、光譜化學等） 結合， 擴展其應用范圍到活體、細胞、單分子等的實時在線分析檢測等。目前， 以光學作為檢測信號的固態納米孔也已取得了一定的進展[93], 固態納米孔也在能源轉換及反應機理研究中獲得應用[94].可以相信， 隨著納米科技的不斷發展及納米孔理論的進一步完善， 更多更具創新性的檢測手段將與納米孔子相結合， 終將推動納米孔分析檢測技術向更高、更深的水平發展， 應用前景更加廣闊。
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