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對(duì)遺傳學(xué)診斷的分析論文
近二十年來，分子遺傳學(xué)的一系列成就，不僅推動(dòng)了分子生物學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，而且對(duì)遺傳疾病的診斷和治療，也應(yīng)用了分子遺傳學(xué)的新技術(shù)如分子雜交、內(nèi)切酶、DNA重組等進(jìn)行了探索，并獲得了有意義的結(jié)果。生物遺傳的基本單位是基因，其遺傳信息貯存在DNA(去氧核糖核酸)分子的堿基序列之中。結(jié)構(gòu)基因就是決定特殊蛋白質(zhì)遺傳密碼的DNA的一個(gè)片段。
一、運(yùn)用單細(xì)胞雙重巢式PCR和MDA技術(shù)方法行性連鎖遺傳病診斷
1、提取男女單個(gè)淋巴細(xì)胞各150例，共300個(gè)細(xì)胞。隨機(jī)分成3組，每組男女細(xì)胞各50個(gè)，雙重巢式PCR技術(shù)在單細(xì)胞水平同時(shí)擴(kuò)增 X-類固醇硫酸脂酶基因(steroid sulfatase gene， STS)/Y-假基因和牙釉質(zhì)基因(Amelogenin，AMEL)，對(duì)照組用單重巢式PCR技術(shù)在單細(xì)胞水平分別擴(kuò)增兩基因，比較單、雙重巢式PCR 技術(shù)在單細(xì)胞水平的擴(kuò)增率及性別診斷正確率。
2、應(yīng)用MDA擴(kuò)增5個(gè)單個(gè)淋巴細(xì)胞和10個(gè)單個(gè)卵裂球全基因組DNA，1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增效率，通過普通PCR即上述巢式PCR的第二輪的PCR條件檢測(cè)細(xì)胞性別來判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的均一性。結(jié)果1、單重巢式PCR擴(kuò)增男性細(xì)胞STS和AMEL的擴(kuò)增率和細(xì)胞性別診斷的正確率分別是84%、76%和84%、84%;而雙重巢式PCR技術(shù)同時(shí)擴(kuò)增上述基因的擴(kuò)增率和性別診斷正確率分別為98%、96%。后者與前兩者相比擴(kuò)增率和性別診斷正確率均明顯提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、P<0.01)。
3、MDA擴(kuò)增5個(gè)淋巴細(xì)胞(3個(gè)為男性細(xì)胞，2個(gè)為女性細(xì)胞)全部擴(kuò)增成功，擴(kuò)增率100%;MDA擴(kuò)增10個(gè)卵裂球有4個(gè)擴(kuò)出產(chǎn)物，擴(kuò)增率為40%。以MDA產(chǎn)物為模板，用STS的第二輪引物檢測(cè)單個(gè)淋巴細(xì)胞性別，正確性為100%;檢測(cè)所有擴(kuò)出產(chǎn)物的卵裂球也均能檢測(cè)出性別，發(fā)現(xiàn)2個(gè)為男性，2個(gè)為女性，可惜的是這4個(gè)卵裂球均來自不同的胚胎，所以不能相互驗(yàn)證。從淋巴細(xì)胞MDA產(chǎn)物檢測(cè)的結(jié)果可以判斷MDA產(chǎn)物也是均一的。結(jié)論1、在單細(xì)胞水平性連鎖遺傳疾病診斷中，雙重巢式PCR技術(shù)較單重巢式PCR技術(shù)具有較高的擴(kuò)增率及診斷正確率，并有助于發(fā)現(xiàn)等位基因脫扣(allele dropout， ADO)。該法在無創(chuàng)性單基因伴性遺傳病的產(chǎn)前診斷和植入前遺傳學(xué)診斷中具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，且經(jīng)濟(jì)、便捷，值得臨床進(jìn)一步推廣。
4、初步預(yù)實(shí)驗(yàn)可知 MDA可以克服單細(xì)胞的模板量少和不可重復(fù)實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)。但由于此次預(yù)實(shí)驗(yàn)的樣本量太小，其穩(wěn)定性、可靠性還需進(jìn)一步摸索，才可以用于單基因病的著床前遺傳學(xué)診斷和產(chǎn)前診斷。
二、利用孕婦外周血漿中小片段游離胎兒DNA進(jìn)行無創(chuàng)性地中海貧血產(chǎn)前基因診斷的研究
方法：收集157例孕婦的外周血，利用柱吸收的方法提取血漿中的cffDNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離富集小片段cffDNA，使用二重PCR 反應(yīng)(dulex-PCR)檢測(cè)SRY基因和磷酸甘油醛脫氫酶(glycerol-dehyde- phosphatedehydrogenase，GAPDH)基因。結(jié)果來源于86例孕男胎的孕婦血漿標(biāo)本的小片段cffDNA均檢出SRY和GAPDH 基因，來源于71例孕女胎的孕婦血漿標(biāo)本的小片段cffDNA只檢出GAPDH基因。與絨毛/羊水標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果以及產(chǎn)后隨訪結(jié)果相符。特異性和敏感性分別為100%(157/157)和100%(86/86)。結(jié)論利用瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，可以選擇性富集孕婦外周血中的小片段cffDNA，相對(duì)地提高胎兒DNA的含量，結(jié)合二重PCR擴(kuò)增SRY基因技術(shù)可用于無創(chuàng)性產(chǎn)前性連鎖遺傳疾病和單基因突變疾病的產(chǎn)前診斷。第二部分利用孕婦外周血漿中 cffDNA進(jìn)行STR-PCR檢測(cè)胎兒基因型目的：利用小片段cffDNA進(jìn)行D5S818、D7S820、D13S317三個(gè)短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)基因型的分析，觀察提取出來的小片段cffDNA中母源性DNA背景對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。
方法：收集了62例孕婦外周血標(biāo)本，提取小片段游離胎兒DNA，利用多重PCR(mutilplex-PCR)的方法分析胎兒的STR基因型，并與父母基因型相比對(duì)。結(jié)果：62例小片段cffDNA的擴(kuò)增結(jié)果中，49例標(biāo)本的擴(kuò)增結(jié)果完全與父母基因型相匹配，未發(fā)現(xiàn)母源性DNA的污染。其余13例在D13S317基因座的擴(kuò)增中出現(xiàn)了母源性DNA的污染。
結(jié)論：經(jīng)過對(duì)小片段cffDNA進(jìn)行富集后，仍有可能出現(xiàn)母源性DNA對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，并且可能影響對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判讀。使用多重PCR反應(yīng)結(jié)合多基因座的擴(kuò)增，可能可以有助于減少母源性DNA的影響，有助于結(jié)果的判讀。第三部分利用孕婦外周血漿中小片段游離胎兒DNA進(jìn)行β-地中海貧血無創(chuàng)性產(chǎn)前基因診斷目的：利用cffDNA對(duì)胎兒進(jìn)行廣西、廣東地區(qū)常見的17種β-地中海貧血基因型的檢測(cè)，與傳統(tǒng)創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷相比較，探討該方法的準(zhǔn)確性和可行性。方法：針對(duì)廣西、廣東地區(qū)常見的β-地中海貧血突變的基因型設(shè)計(jì)三對(duì)不同引物，并用生物素標(biāo)記。對(duì)cffDNA進(jìn)行二次PCR反應(yīng)后，使用反向斑點(diǎn)雜交(revert dot-blot hybridization，RDB)檢測(cè)胎兒的β-珠蛋白基因型，與創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷結(jié)果比較，觀察準(zhǔn)確率。
結(jié)果：37例cffDNA標(biāo)本檢測(cè)中，檢出重型β-地中海貧血19例，輕型β-地中海貧血11例，正常7例，與創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷結(jié)果相比較出現(xiàn)3例誤診，準(zhǔn)確率為91.9%(34/37)。結(jié)論：利用 cffDNA進(jìn)行β-地中海貧血的檢測(cè)，可能出現(xiàn)母源性DNA背景的污染，當(dāng)胎兒基因型與母親基因型相同時(shí)，必須提高警惕，進(jìn)一步分析或者復(fù)查。因?yàn)樵摷夹g(shù)取樣容易，對(duì)孕婦胎兒無風(fēng)險(xiǎn)，不受孕期時(shí)間影響，易為與孕婦接受，因此進(jìn)一步改進(jìn)該技術(shù)后有望可用于β-地中海貧血的診斷。第四部分利用孕婦外周血漿中小片段游離胎兒DNA進(jìn)行巴氏水腫胎兒檢測(cè)目的：通過檢測(cè)cffDNA以及母源性cfDNA在PCR反應(yīng)中擴(kuò)增效率的不同，進(jìn)行檢測(cè)巴氏水腫胎兒(Hb Bart’s hydrops foetus)的方法學(xué)研究。方法：對(duì)來源于擬診孕水腫胎兒孕婦的小片段cffDNA，進(jìn)行熒光PCR(Fluorescence PCR)擴(kuò)增，利用毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis，CE)技術(shù)判斷兩種產(chǎn)物峰面積比(peak area ratio)來檢測(cè)巴氏水腫胎兒。結(jié)果：30例擬診巴氏水腫胎兒的小片段cffDNA擴(kuò)增結(jié)果提示，巴氏水腫胎兒兩種產(chǎn)物鋒面積比遠(yuǎn)遠(yuǎn)<1。而其他原因所致的水腫胎兒的cffDNA模板擴(kuò)增結(jié)果顯示兩種產(chǎn)物封面值比近似等于1。
結(jié)論：
通過熒光PCR和毛細(xì)管電泳的方法，有望利用cffDNA進(jìn)行巴氏水腫胎兒的無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷。
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