參環毛蚓體內核苷磷酸化酶的活性測定及動力學分析論文

　　參環毛蚓Pheretima aspergillum(E. Perrier)屬鉅蚓科動物，藥材習稱“廣地龍”，是《中華人民共和國藥典》收載的 4 種來源動物中品質最優者。在廣地龍入藥的四千多年歷史中，其平喘作用為臨床常用。由于次黃嘌呤及黃嘌呤是目前已知地龍平喘作用的重要物質基礎，因此，次黃嘌呤的存在與否及含量高低自然成為評價廣地龍平喘藥效的重要指標性成分。迄今為止，參環毛蚓體內次黃嘌呤的合成代謝途徑研究尚屬空白，無法了解次黃嘌呤如何生成及影響和控制其產量與代謝方式的因素。眾所周知，酶是細胞內生物化學反應的催化劑，其存在與否及活性的高低直接影響產物的形成和產量。據此，本研究借鑒國外相關研究成果，以次黃嘌呤代謝過程中產生重要作用的嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)為主要研究對象，構建能快速準確檢測參環毛蚓體內 PNP 酶活性的方法，考察該酶活性效應及其作用規律，為進一步確認及探究參環毛蚓體內嘌呤合成代謝途徑，解析其調控機制奠定實驗基礎。

　　1材料與方法

　　1.1儀器及試劑 P680A LPG 高效液相色譜系統、ASI-100 自動進樣器、UVD170U 紫外檢測器，美國戴安公司;TL-18M 臺式高速冷凍離心機，上海市離心機械研究所有限公司;TG16-W 微量高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;SG8200HE 超聲波清洗機，鄭州南北儀器設備有限公司;BP211D 十萬分之一精密電子天平，德國賽多利斯公司。

　　1.2實驗動物 樣本采自廣東省廣州市番禺區，經廣州中醫藥大學李薇教授鑒定為鉅蚓科動物參環毛蚓Pheretima asperfillum(E.Perrier)。選擇體型健碩、活力較強、性成熟、體表具有明顯生殖環帶、平均濕質量約 14.1 g 的健康成蚓，經無菌超純水清洗后，放入鋪有濕潤滅菌濾紙的塑料箱中，在室溫(22±2)℃下，避光培養 48 h 以備用。

　　1.3標準溶液配制與樣品處理

　　1.3.1標準溶液配制 精密稱取肌苷標品 3.88 mg，次黃嘌呤標品 2.51 mg，分別置于 2 mL 量杯中，用 PBS緩沖液溶解并定容至 10 mL 的容量瓶，均稀釋為 500滋mol·L-1作為母液，置于 4 ℃冰箱中備用。

　　1.3.2參環毛蚓粗蛋白的制備 解剖活體參環毛蚓，去除腸道后剪取體壁組織用 PBS 緩沖液浸泡潤洗 3次，轉移至培養皿剪碎后用勻漿器研磨，以 0.1 mo·lL-1pH7.4 的 PBS 緩沖液為溶劑，將組織液轉移至離心管，4℃ 12000 r·min-1離心 30 min，將提取液分裝，-20 ℃保存備用。以小牛血清蛋白(BSA)為標準品，采用 Bradford 法測定粗蛋白含量。

　　1.4色譜條件 采用 Ecosil C18-AQ 柱 (250 mm×4.6mm，5滋m)，流速為 0.8 mL·min-1，柱溫為室溫，檢測波長為 254 nm。流動相 A 為 10 mmol·L-1磷酸二氫銨緩沖液，用磷酸調 pH 至 4.5，B 為 10 %甲醇。采用梯度洗脫：0～10 min A-B(50∶50)，10～15 minA-B (20∶80)，15～25 min A-B (0∶100)，25～35min A-B(0∶100)。

　　2結果

　　2.1方法學考察結果

　　2.1.1方法專屬性 在優化的色譜條件下，肌苷峰型良好，與代謝產物分離良好。

　　2.1.2標準曲線的繪制與檢測限 取次黃嘌呤標準液，用 PBS 緩沖液稀釋成 0.5，2，4，5，10，15，20，40滋mol·L-1的系列標準液，取 10滋L 按色譜條件進行 HPLC 分析，測定次黃嘌呤含量(n=5)。以次黃嘌呤峰面積Y為縱坐標，次黃嘌呤濃度(X，滋mol·L-1)為橫坐標，繪制標準曲線。結果表明次黃嘌呤在0.5~40滋mol·L-1濃度范圍內線性關系良好，回歸方程為：Y=0.0653X-0.0394，r=0.9996。次黃嘌呤檢測限為 0.05滋mol·L-1(S/N≥3)。

　　2.2肌苷在參環毛蚓組織粗蛋白中的酶反應動力學

　　2.2.1蛋白濃度考察 為了考察參環毛蚓體壁組織酶反應體系中合適的蛋白濃度，以不同蛋白濃度(X)與產物次黃嘌呤的濃度增加量繪制曲線。結果表明樣品的蛋白濃度在 0～7.5 mg·mL-1范圍內，與產物濃度變化量呈線性關系，因此在該濃度范圍內的廣地龍粗蛋白提取物可用于酶活性分析。

　　2.2.2孵育時間考察 為了考察適當的的孵育時間，以產物濃度與孵育時間繪制曲線，結果見圖 3。在0～30 min 的反應時間內，酶促反應呈線性上升，而30 min 后，酶活力基本穩定，說明酶促反應已完成，處于穩定狀態，故選用孵育時間 30 min 作為酶活力測定的時間。

　　3討論

　　在酶活性的檢測方法中，高效液相色譜法因其靈敏度高、選擇性好而應用廣泛，尤其是對目標成分的檢測能做到快速、準確、實時的特點，更受國內外學者的歡迎。本研究參考了文獻有關 HPLC 方法，并以此為基礎對流動相的比例、梯度洗脫條件進行了改進及優化，實現了底物與產物之間的良好分離。

　　對酶活性的測定是通過檢測單位時間、單位體積中底物的減少量或產物的增加量來實現的，即測定酶反應的速度。而酶反應速率受蛋白濃度和反應時間影響，只有當反應速率與蛋白濃度及孵育時間均顯線性關系時，才是酶活性的真實表現。因此，本研究考察了酶反應體系所需的最佳蛋白濃度和孵育時間。首次建立了參環毛蚓體內次黃嘌呤代謝酶活性測定相關的實驗體系，為進一步研究平喘有效物質的代謝途徑及其調控機制提供了良好的實驗平臺。

　　鑒于國外有研究學者已從寄生蟲和哺乳類動物體內發現 PNP 是主導次黃嘌呤生成的關鍵酶。因此，本研究選取了 PNP 作為研究對象。此外，與嘌呤合成代謝途徑相關的酶還有腺苷脫氧酶(ADA)和黃嘌呤氧化酶(XO)。本實驗除了 PNP 外，還利用上述實驗體系對 ADA 和 XO 也進行了酶活性分析，獲得相應的動力學參數。此研究結果與國外已報道的人紅細胞、寄生蟲等嘌呤合成代謝途徑關鍵酶活性的結果頗為一致。由此，提示參環毛蚓體內有可能也存在類似嘌呤合成代謝途徑。

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