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高效液相色譜法測定白花蛇舌草中槲皮素的含量
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【摘要】 目的 建立高效液相色譜法測定白花蛇舌草中槲皮素含量的方法。方法 采用Hypersil BDS C18色譜柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)，流動相為甲醇?水?磷酸(體積比50∶50∶0.2) ，檢測波長為370 nm。結(jié)果 槲皮素在0.08～ 0.32 μg 的范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關系(r=0.999 6)，平均加樣回收率為101.5%，RSD為0.8%(n=6)。結(jié)論 本法快速、簡便、準確，可用于測定白花蛇舌草中槲皮素的含量，為評價白花蛇舌草的內(nèi)在質(zhì)量提供科學依據(jù)。
【關鍵詞】 白花蛇舌草 槲皮素 含量測定 高效液相色譜法
白花蛇舌草為茜草科植物白花蛇舌草(Hedyotis diffusa Willd.)的干燥全草，研究表明該植物主要含有黃酮類、三萜類、蒽醌類、環(huán)烯醚苷萜類、甾醇類、烷烴類等化學成分，具有抗肝炎、抗腫瘤、抗病毒、抗炎抑菌、降血脂及降血糖等多種藥理活性[1]。白花蛇舌草中黃酮類化合物的含量測定未見文獻報導，本文采用HPLC法測定了白花蛇舌草中槲皮素的含量，為評價白花蛇舌草的內(nèi)在質(zhì)量提供科學依據(jù)。
1 儀器與藥品
高效液相色譜儀：P230高壓恒流泵/DAD230二極管陣列檢測器(大連依利特分析儀器有限公司)，Hypersil BDS C18色譜柱(4.6 mm×200 mm，5μm，大連依利特分析儀器有限公司);電子精密天平(Ohaus);KS?1500超聲清洗器(寧波科勝儀器廠);高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)。
白花蛇舌草(市售，批號2006001，2006002，2006003)，經(jīng)本校藥植教研室陳再興老師鑒定均為白花蛇舌草(Hedyotis diffusa Willd.);槲皮素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號100081-200406，供含量測定用);甲醇為色譜純;水為重蒸水。
2 結(jié)果與分析
2.1 色譜條件
色譜柱：Hypersil BDS C18色譜柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)，流動相：甲醇?水?磷酸(體積比50∶50∶0.2);檢測波長：370 nm，流速：1 mL/min，柱溫：25 ℃ ，進樣量：20 μL。色譜圖見圖1、2。
2.2 對照品溶液的制備
精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥過夜的槲皮素對照品適量，加甲醇制成每1 mL含槲皮素10 μg的溶液，即得。
2.3 樣品溶液的制備
取白花蛇舌草藥材粗粉1.0 g，精密稱定，置燒瓶中，精密加入50%(體積分數(shù))甲醇20 mL和鹽酸1 mL，密塞，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，用50%(體積分數(shù))甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜 (0.45 μm) 濾過，取續(xù)濾液，即得。
2.4 系統(tǒng)適用性試驗
分別取對照品溶液、供試品溶液各20 μL進樣測定，理論塔板數(shù)為15 000，供試品溶液色譜圖中槲皮素峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度大于1.5。
2.5 線性關系的考察
精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥過夜的槲皮素對照品10.0 mg，加甲醇定容至100 mL，分別精密量取上述對照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL 置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成系列濃度的溶液。分別精密吸取各溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以槲皮素峰面積(A)為縱坐標，槲皮素進樣量(m)為橫坐標，繪制準曲線，得回歸方程為A=274.79m+54.43，r=0.999 6，結(jié)果表明槲皮素在0.08～0.32 μg范圍內(nèi)與峰面積成良好線性關系。
2.6 精密度試驗
取槲皮素對照品溶液20 μL ，重復進樣6次分別測定峰面積為2 949，2 911，2 891，2 946，2 950，2 957， RSD為0.9%(n=6)，結(jié)果表明精密度良好。
2.7 穩(wěn)定性試驗
取供試品溶液(批號2006001)，分別在2、4、6、8、10、12 h進樣，測得槲皮素峰面積為1 437，1 422，1 451，1 430，1 421，1 425，RSD為0.8%，結(jié)果表明供試樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.8 重現(xiàn)性試驗
取同一批號的白花蛇舌草5份，按“2.3”制備樣品溶液，進行測定，測得槲皮素的峰面積為1 447，1 452，1 425，1 419，1 423，RSD為1.1%(n=5)，結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性良好。
2.9 回收率試驗
精密稱取已知含量的白花蛇舌草(批號2006001)5份，分別加入槲皮素對照品適量，按“2.3”制備供試品溶液，測定含量，結(jié)果測得回收率101.8%，102.4%，101.9%，101.1%，100.4%，平均值為101.5%;RSD為0.8%。
2.10 樣品測定
分別取白花蛇舌草藥材3批(批號2006001，2006002，2006003)，按“2.3”制備供試品溶液，進樣測定，結(jié)果測得槲皮素質(zhì)量分數(shù)分別為：0.091 3，0.085 7和0.088 0 mg/g。
3 討 論
3.1 文獻報道槲皮素的檢測波長為360nm[2,3]、254 nm[4] 、368 nm[5]，本文利用DAD二極管陣列檢測器對槲皮素對照品進行全波長掃描，結(jié)果最大吸收峰為370.2 nm，故選擇370 nm為檢測波長，見圖3。
3.2 實驗考察了不同比例的甲醇?水為流動相，最后確定流動相為甲醇?水?磷酸(體積比50∶50∶0.2)，柱溫25 ℃，流速1 mL/min，樣品中槲皮素達到良好的分離。
3.3 白花蛇舌草中黃酮類化合物的含量測定未見文獻報導，本文采用高效液相色譜法測定了白花蛇舌草藥材中槲皮素的含量，操作簡便、快速，可作為白花蛇舌草質(zhì)量控制的有效手段。
【參考文獻】
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