国产欧美日韩在线观看一区二区,欧美乱码精品一区二区三区,国产粉嫩高中无套进入,中文在线天堂网www

報告

SDS研究實驗報告

時間:2024-09-15 14:19:26 報告 我要投稿
  • 相關(guān)推薦

SDS研究實驗報告

  一、研究背景及目的

SDS研究實驗報告

  對于那些生物體內(nèi)含量高、易于分離結(jié)晶獲得純品的蛋白,可以通過測定氨基酸序列,借助各種氨基酸的分子量求出蛋白的分子量,并與質(zhì)譜等手段相互結(jié)合,得到精確可信的分子量。但對于那些含量少,不易分離的蛋白,無法實現(xiàn)結(jié)晶,就必須借助其他手段測定其分子量。

  要找到能夠測定分子量的實驗手段,首先要考慮那些能夠?qū)⒉煌肿影凑掌涓髯缘姆肿恿糠蛛x的技術(shù)。在眾多的技術(shù)當(dāng)中,密度梯度離心、層析、電泳都與物質(zhì)的分子量有關(guān)。其中,超速離心機造價高,使用過濾層析色譜測分子量要做標(biāo)準(zhǔn)曲線,柱長要求高,且這些方法不夠準(zhǔn)確。因此,電泳技術(shù)成為了實現(xiàn)分子量測定這一目的的最佳選擇。

  但是,在活性電泳中,影響蛋白前遷移率的因素有蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)、分子大小和形狀。要測定分子量,就要消除電荷、分子形狀對蛋白遷移率的影響,即使得各種蛋白的電荷、形狀不存在顯著差異。對于電荷,使各分子不帶電違背電泳的基本原理,而使各分子帶點完全相同是無法實現(xiàn)的,因此考慮使其帶上大量電荷,從而讓分子之間的電荷差異可以忽略。在活性電泳中,改變樣品的帶電情況依靠的是緩沖液pH的變化,顯然不能夠使分子大量帶電,這就表明必須向電泳體系中引入其他物質(zhì),與蛋白分子定量等量結(jié)合,且不改變分子量差異造成泳動差異。對于分子形狀,考慮到功能性蛋白大多是球形粒子,要保持形狀不變,就要實現(xiàn)對蛋白的包裹性結(jié)合。而蛋白表面的電荷分布情況千差萬別,依靠電荷性質(zhì)無法結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物。考慮到蛋白質(zhì)中含有大量的疏水氨基酸,可以通過疏水作用結(jié)合,這就要造成蛋白變性,是疏水基團(tuán)充分暴露出來,分子不能在維持球型而變成棒狀,因此,所選擇的物質(zhì)還需要能夠維持復(fù)合物形狀的統(tǒng)一。基于以上考慮,科學(xué)家選擇了雙親性物質(zhì),既能通過疏水作用與蛋白定量結(jié)合成牢固的復(fù)合物,又能借助親水性在溶液中良好分散。

  新技術(shù)的發(fā)明常以原有技術(shù)作為基礎(chǔ)。在活性電泳中,采用堿性體系,依靠濃縮效應(yīng)實現(xiàn)了樣品的濃縮,大大提高了分析的精度。而變性電泳屬于全蛋白染色,結(jié)果較準(zhǔn)確。在變性電泳中,要借助濃縮效應(yīng),就要使樣品由負(fù)極向正極遷移,那么所選擇的物質(zhì)與蛋白結(jié)合之后要形成帶負(fù)電的復(fù)合物。就這樣,選擇了十二烷基硫酸鈉(SDS)作為變性劑。而且,發(fā)現(xiàn)形成的復(fù)合物成棒狀,短軸恒定,而長軸與分子量相關(guān)。所以,SDS就成為了理想的變性劑。這種方法最適宜測定分子量是15,000—100,000的樣品, 對低于10,000分子量的水解蛋白不太適用。通過改進(jìn),用強電解質(zhì)離子為前導(dǎo)離子和拖尾離子可對分子量低于10,000的水解蛋白樣品進(jìn)行分子量測定。用這種方法測定蛋白質(zhì)的分子量,分辨率高,所需設(shè)備廉價,與用其他方法測得的分子量相比,誤差一般在±10%以內(nèi),因而其廣泛應(yīng)用于蛋白分離純化和分子量測定。

  因此,SDS-PAGE是目前常用的測定蛋白質(zhì)分子量的方法。本實驗通過利用SDS-PAGE測定實驗四純化的麥清蛋白,學(xué)習(xí)和掌握SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)分子量的原理,掌握其具體操作;并與活性電泳進(jìn)行對比,了解其異同,加深對電泳技術(shù)了理解。

  二、實驗原理

  1、聚丙烯酰胺凝膠電泳可對蛋白質(zhì)的種類和數(shù)量做定性分析,帶電蛋白質(zhì)分子在電場作用下將作定向移動,在其他條件( 電場、介質(zhì)粘度等) 不變的情況下, 蛋白質(zhì)在凝膠中的遷移速率受分子所帶凈電荷量與分子大小、形狀等因素的影響。如果兩種不同分子量的蛋白質(zhì)的分子大小的差異被所帶凈電荷量的差異所補償時,則這兩種不同分子量的蛋白質(zhì)可以相同的速率電泳,無法通過電泳距離測定蛋白質(zhì)的分子量。因而要測定分子量則需要蛋白質(zhì)以分子量為唯一變量進(jìn)行泳動,即需要引入某種物質(zhì)與蛋白結(jié)合消除凈電荷和分子形狀的影響。

  由于變性電泳由活性電泳發(fā)展而來,濃縮效應(yīng)是在堿性體系下建立的,在此體系下蛋白質(zhì)帶負(fù)電,又由于蛋白質(zhì)的等電點普遍低于7,在堿性體系下不同蛋白質(zhì)所帶電荷量不同,自身差異更大,分離效果更好。因而要引入的這一能消除蛋白質(zhì)自身所帶凈電荷的物質(zhì)在電泳體系下應(yīng)帶負(fù)電荷。另一方面,我們要引入的物質(zhì)應(yīng)能與蛋白質(zhì)普遍穩(wěn)定地定量結(jié)合,結(jié)合后不同分子量的多肽鏈形狀類似,使各多肽鏈間的差別集中在分子量上。

  通過試驗與實踐,人們找到了一種雙親性物質(zhì)即SDS,SDS是十二烷基硫酸鈉的簡稱,是一種很強的陰離子表面活性劑,SDS以其疏水基和蛋白質(zhì)分子的疏水區(qū)相結(jié)合,形成牢固的帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物,由于SDS的結(jié)合,所引入的凈電荷大約為蛋白質(zhì)本身凈電荷的10倍,使SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物所帶電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)原有的凈電荷,從而消除或大大降低不同蛋白質(zhì)之間所帶凈電荷的不同對電泳遷移率的影響。在分子形狀方面,SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物具有扁平而緊密的橢圓形或棒狀結(jié)構(gòu),棒的短軸是恒定的,在18A數(shù)量級,與蛋白質(zhì)種類無關(guān),棒的長軸是變化的,其變化正比于蛋白質(zhì)分子量。說明SDS和蛋白質(zhì)結(jié)合所形成的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物消除了由天然蛋白質(zhì)形狀的不同而對電泳遷移率的影響。

  2、在SDS的存在下,蛋白質(zhì)在電場中泳動時其遷移率僅與蛋白質(zhì)分子質(zhì)量有關(guān)。二者的關(guān)系式為:lgM=ab

  其中,M為相對分子質(zhì)量,Rm為相對遷移率——蛋白質(zhì)在凝膠中的遷移距離與指示劑前沿距離的比值,a、b為常數(shù)。從上式可知,蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的對數(shù)與蛋白質(zhì)遷移率呈線性負(fù)相關(guān)。在同一塊電泳凝膠上對一組已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)和蛋白樣品分別進(jìn)行SDS-PAGE分析,以標(biāo)準(zhǔn)蛋白的遷移率為橫坐標(biāo),以分子質(zhì)量的對數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,從未知蛋白質(zhì)的遷移率即可求出蛋白質(zhì)亞基的分子質(zhì)量。

  三、儀器與試劑

  實驗材料:實驗四麥清蛋白脫鹽樣品

  實驗試劑:三羥甲基氨基甲烷(Tris);丙烯酰胺(Acr);甲叉雙丙烯酰胺(Bis);十二烷基硫酸(SDS);N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED);過硫酸銨;甘油;巰基乙醇;異丙醇;溴酚藍(lán);考馬斯亮藍(lán)R-250;甘氨酸;鹽酸;乙酸;冰乙酸。

  實驗儀器:直流穩(wěn)壓電源(600V,100mA);移液器;燒杯(50ml×2);實驗儀器:DYY-Ⅲ2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京市六一儀器廠);DYY-III2電泳槽(北京市六一儀器廠);微量進(jìn)樣器50μl(上海安亭微量進(jìn)樣器廠);大培養(yǎng)皿一套。

  試劑配制:

  實驗儀器:DYY-III2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀一套(北京市六一儀器廠)、燒杯50ml×3,微量進(jìn)樣器(上海安亭微量進(jìn)樣器廠)、大培養(yǎng)皿一套、微量可調(diào)手動移液器(大龍)。

  四、實驗方法

  1、貯液配制(教師完成)

  按照實驗指導(dǎo)43頁配制貯液,注意:配好的丙膠貯液盛于棕色瓶中置冰箱中保存,可放1~2個月;過硫酸銨和染色液應(yīng)當(dāng)天配制;電極緩沖液用時稀釋10倍;如有不容物應(yīng)當(dāng)過濾。

  2、凝膠的制備

  (1)將貯液由冰箱取出,待與室溫平衡后再配制工作液。

  (2)安裝電泳槽。安裝時,注意旋緊螺絲時要均衡用力,以免夾碎玻璃片。

  (3)用2%瓊脂封底,以防漏膠。

  (4)按下表所示配制分離膠

  在小燒杯中混勻后,立即灌膠。灌膠時,將電泳槽稍傾斜,用手扶穩(wěn),將小燒杯尖端抵在長玻璃片頂端,小心將溶膠倒入兩玻璃片之間,灌至據(jù)短玻璃片頂端2cm左右即可,放平電泳槽,立即用滴管在膠的上層小心輕緩地覆蓋2~3mm的水層。灌注水層是要均勻輕緩,以防在膠頂部產(chǎn)生漏洞,影響結(jié)果,剛加水時,可以看出界面,后逐漸消失;等到再出現(xiàn)界面時,表明分離膠已經(jīng)聚合,再靜置一會兒,將水倒出,用濾紙條從一側(cè)略微吸浸,注意不要碰毀膠面,準(zhǔn)備灌注濃縮膠。

  (5)按下表配制濃縮膠

  混勻后立即灌膠,操作同上,至膠面與短玻璃片頂端平齊,立即插入樣品槽模板(梳子)。聚合完成后,在電泳槽內(nèi)倒入電極緩沖液,使短玻璃片一側(cè)電極緩沖液沒過玻璃片頂端,長玻璃片一側(cè)電極緩沖液沒過電極絲,然后小心拔出梳子,準(zhǔn)備點樣。

  3、樣品的處理

  Marker:市售標(biāo)準(zhǔn)樣品按要求制備。

  待測樣品:麥清蛋白初步提取的凝膠過濾脫鹽實驗所獲峰值管制備的SDS-PAGE樣品。 所有樣品于沸水浴中加熱5min,冷卻后上樣。

  上樣量:Marker 20μl,待測樣品4μl、10μl、20μl、30μl、50μl。

  4、電泳

  接好電源線(上槽接負(fù)極,下槽接正極)。打開電源開關(guān),調(diào)節(jié)電流,初始時控制在15mA左右,當(dāng)前沿進(jìn)入分離膠后,可調(diào)節(jié)電流到25mA左右。實驗中溴酚藍(lán)前沿指示劑不能跑丟。

  5、檢測

  電泳結(jié)束后,取出膠板,現(xiàn)在水中浸泡10min,以浸出部分SDS,然后把膠板轉(zhuǎn)到染色液中過夜,將蛋白質(zhì)固定并染色(或加熱2h,在通風(fēng)櫥中操作)。然后用脫色液脫至條帶清楚,觀察記錄結(jié)果。

  6、測定蛋白質(zhì)樣品的遷移率和未知樣品的分子量

  用卡尺或坐標(biāo)精確測量溴酚藍(lán)和各種蛋白質(zhì)遷移的距離,記溴酚藍(lán)遷移的距離為d1,蛋白質(zhì)遷移的距離為d2,根據(jù)下面的公式計算出各種蛋白質(zhì)的遷移率Rm:Rm=d2/d1。

  以標(biāo)準(zhǔn)蛋白的遷移率為橫坐標(biāo),以其對應(yīng)的分子量的對數(shù)值為縱坐標(biāo)作圖。然后給句待測樣品的遷移率,在圖上查出其對應(yīng)的分子量。并由所得結(jié)果分析實驗四麥清蛋白初步提取的實驗效果以及后續(xù)進(jìn)一步分離純化的方案。

  五、數(shù)據(jù)整理及結(jié)果計算與討論及分析

  (一)結(jié)果計算與分析

  以marker蛋白的遷移率Rm為橫坐標(biāo),對應(yīng)蛋白分子量的對數(shù)為縱坐標(biāo),做出本次實驗的SDS-PAGE分子質(zhì)量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

  有上可得,標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為y = -1.1355x + 5.0731。其R2 = 0.9639,曲線可用。將麥清蛋白的相對遷移率0.2287帶入曲線方程,得到其分子量的對數(shù)為4.8134,則其分子量為65072Da,約為65.1kDa。

  (二)討論

  本次實驗與上次的活性電泳不同,除了跑在最前面的溴酚藍(lán)前沿,還有一個蛋白前沿。蛋白前沿的產(chǎn)生是因為在實驗中有些蛋白降解為較短的小肽段,分子量僅比溴酚藍(lán)大一些,遷移速度超出了其他蛋白,且在膠板中發(fā)生側(cè)向擴散,形成蛋白前沿。同時,靠近蛋白前沿的部分有大量分子量較小的蛋白樣品聚集,它們并非我們需要 品,因為分離膠不夠長而沒有分開。

  本次實驗我組順利的將marker的七條帶均勻跑開并顯現(xiàn)出來,說明這次實驗中我組在操作上基本無大的問題。對于最后一條marker帶出現(xiàn)上翹情況,經(jīng)與老師分析討論后,認(rèn)為對于偏向下部的條帶尤其是靠近底部的條帶,會受到膠板邊緣效應(yīng)的影響,會發(fā)生偏折。因此在今后的實驗操作中,對于這種情況,應(yīng)避免使用此處的marker進(jìn)行計算。

  我們指定了靠近Marker第二條帶的一條顏色很深的條帶作為目標(biāo)蛋白,這是因為這一蛋白含量相對較高,與其他蛋白明顯分離開來。通過上面的計算,得到這種蛋白的相對分子質(zhì)量為65.1kDa。

  在對Marker進(jìn)行作圖的時候,我們發(fā)現(xiàn)116.0kDa的條帶并不在直線上,其遷移的距離明顯超過了應(yīng)有的遷移距離,說明在電泳過程中這個蛋白遷移速度過快。考慮到其他條帶的遷移正常,我們認(rèn)為可能的原因有兩個:一是Marker本身的質(zhì)量問題,標(biāo)稱116.0kDa的蛋白分子量不足116.0kDa;二是凝膠組成的問題。實驗中所用的凝膠孔徑過大,導(dǎo)致凝膠對分子量最大的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的阻礙作用不足,使這個蛋白遷移速度超出了本來應(yīng)有的速度。

【SDS研究實驗報告】相關(guān)文章:

市場研究實驗報告范文03-03

研究實驗報告三篇06-25

初三物理研究電磁鐵實驗報告范文06-19

實驗報告11-15

實驗報告06-21

化學(xué)的實驗報告11-16

電路實驗報告11-23

實驗報告范文02-06

實驗報告 范本02-02

關(guān)于實驗報告02-17

主站蜘蛛池模板: 欧美 国产 综合 欧美 视频| 18?视频???动漫| 国产熟妇按摩3p高潮大叫| 午夜精品久久久久久毛片| 国产区精品福利在线社区| 国农村精品国产自线拍| 日韩精品专区在线影院重磅| 精品一区二区三区av天堂| 97影院理论片手机在线观看| 亚洲综合欧美在线…| 国产成人精品亚洲一区| 无码人妻精品一区二区三区久久| 麻豆精品久久久久久久99蜜桃| 夜夜躁狠狠躁日日躁视频| 妇女bbbbb撒尿正面视频| 亚洲精品一区国产精品丝瓜| 国产丝袜美女一区二区三区| 男女裸交无遮挡啪啪激情试看| 无码人妻一区二区三区免费n鬼沢| 中文有码亚洲制服av片| 香蕉视频在线精品视频| av在线网站无码不卡的| 婷婷婷国产在线视频| 亚洲一区精品二人人爽久久| 精品一区二区三区在线视频| 人妻少妇heyzo无码专区| 三上悠亚免费观看av网站| 男女一边摸一边做爽爽的免费阅读| 亚洲成av人片在线观看无app| 亚洲欧洲国产码专区在线观看| 国产成人av在线免播放观看| 风流老太婆大bbwbbwhd视频| 人妻丝袜中文无码av影音先锋专区| 精品国产乱码久久久久软件| 日韩精品一区二区大桥未久| 不卡一卡二卡三乱码免费网站| 天天躁夜夜躁狠狠是什么心态| 久久99国产精品久久99软件| 亚洲精品成人久久久| 久草热8精品视频在线观看| 国产精品色情国产三级在|