微生物培養技術初探-農業生物技術論文

　　論文摘要：文章簡要介紹了微生物不可培養的原因，總結了培養技術中存在的問題，提出如何改良培養微生物的技術，并闡述了模擬自然環境條件、強調微生物相互關系是提高微生物可培養性的關鍵。

　　論文關鍵詞：微生物;培養技術;環境條件;生物細胞

　　目前自然界中只有極少部分微生物能夠得到培養，嚴重阻礙了對微生物生命活動規律的研究和微生物資源的開發。因此必須改進傳統培養方法，采用新型培養技術，提高微生物可培養性，大量培養自然界中存在的微生物，從而更全面、準確地了解微生物細胞的生命規律、獲悉微生物群落中各種微生物之間的動態相互作用和相互協調的規律，對環境微生物工藝進行準確地設計、精細地調控和高效地利用。

　　一、微生物不可培養的原因

　　對微生物進行常規培養時，由于生活條件的改變，有些微生物不能適應而死亡，另一些則通過產生孢子進入休眠狀態或改變細胞形態、進入維持一定代謝活性但不生長繁殖的“活的非可培養狀態”，結果均表現為微生物的“不可培養性”。

　　實際上，微生物的不可培養性是由于對微生物生長條件及其規律性的認識嚴重不足，而采取了偏離微生物生長實際情況的培養條件所造成的，這些偏離具體可以包括以下幾個方面：

　　(一)實驗室中無法完全模擬自然界的環境條件

　　由于目前監測技術和手段的限制，人們對微生物生存環境和自然條件的了解尚不充分。因此，人們沒有或無法完全模擬微生物的自然生存條件，而通常將培養條件進行簡化：將微生物置于恒溫、恒濕、黑暗等環境中;將微生物限制在“板結”的瓊脂或不擾動的液體介質中;簡化微生物的營養組成沒有提供微生物生長繁殖所必需的某些化學物質等等。所以在自然界中可以生長繁殖的微生物，在“純培養”中生長條件得不到滿足，從而導致了微生物的不可培養性。

　　(二)生長緩慢的微生物被忽視

　　環境中很多微生物都聚集生長，當將這些微生物接種至培養基時，適合生長的微生物由于生長快而占據優勢地位，它們對營養成分的大量攝取使生長緩慢的微生物得不到充足營養而生長受到抑制。

　　(三)采用高濃度的營養基質

　　最初對微生物的培養是在富含營養的培養基中進行的，但是由于自然界中微生物數量龐大，其可利用的營養物質極度匱乏，多數處于“岔營養”狀態。常規純培養對這種認識不允分，通常將寡營養微生物迅速置于富營養狀態，微生物初期的快速生長會產生大量的、微生物自身難以調節的過氧化物、超氧化物和羥基自由基等“毒性氧物質”，該類物質快速、過量的積累會破壞細胞內膜結構，導致細胞死亡，從而表現出微生物的不可培養性。

　　(四)環境微生物之間的相互關系被忽略

　　微生物相互關系繁多復雜，包括：(1)種間的偏利共生關系和互惠共生關系，兩者的共性是至少一個群體提供另一些群體所需的生長因子而使微生物群體獲利;(2)群體感應，這種關系被認為是通過細菌間的信息交流來調控細菌的群體行為：細胞通過感應一種胞外低分子量的信號分子來判斷菌群密度和周圍環境的變化，從而調節相應的細菌表達以調節細菌的群體行為。以上這兩種關系都是微生物生長所必需的。由于人們目前對環境中微生物之間多數復雜的相互關系所知甚少，采用的培養技術沒有將這種關系考慮在內。純培養技術將待培養的微生物與其它微生物群體、以及生存環境人為地分離開，種間的共生關系和信息交流被阻斷，微生物缺乏必需的生長因子和信號分了而死亡，表現出微生物的不可培養性。

　　(五)對微生物生長狀況進行判斷的常規標準存在的缺陷，也導致某些微生物生長不被發覺，表現為“不可培養”

　　例如，生存在貧營養環境中的微生物盡管能夠在低濃度營養條件下生長，但是有些微生物生長速度極為緩慢，在常規設定的培養周期內(例如l周)沒有長成肉眼可見的菌落就被遺棄。除此之外，還有一些寡營養微生物不會形成菌落，而是在固體培養基表面遷徙生長和擴散生長，它們形成只能顯微可見的幾個細胞組成的小型集合。這兩種情況下，改變微生物生長的判斷標準或者檢測方法，就可以改變微生物的“不可培養性”。

　　總之，導致微生物不可培養的因素有多種，有些是因為目前技術手段的限制，有些是因為人類認識水平的不足。克服這些制約因素，就可以較好地提高微生物的可培養性。目前，提高微生物可培養性的方式可分為兩大類，即改進培養措施和開發新型培養技術。

　　二、目前微生物培養技術存在的問題

　　目前通過可培養微生物的總體數量來判斷微生物可培養性，進而評價微生物培養方法的優劣，然而，這項評價指標沒有考慮可培養微生物的群落結構。實際上，表征微生物可培養性不僅僅要根據可培養微生物的總體數量，還要分析可培養微生物的群落結構，即可培養微生物的種類豐富度和均勻度，微生物可培養性指標應該是這3種因子的函數，即：C=f(P，R，E)，其中：

　　C——微生物的可培養性，反映可培養微生物的種類和數量占實際微生物總種類和數量的比例;

　　P——可培養微生物的細胞數(CFU/L)，即傳統可培養性的涵義;

　　R——可培養微生物的種類豐富度，即可培養微生物的種類數目;

　　E——可培養微生物的種類均勻度。

　　E=■=■

　　其中：H——香農-韋納指數;

　　Pi——種i的個體在可培養微生物全部個體中的數量比例。

　　該公式中，各因素的重要性為R>P>E，即可培養微生物的種類豐富度重要性最高。

　　在目前實行的幾種培養方法中，模擬自然環境條件，維持微生物種群間的相互關系是提高環境中微生物可培養性的關鍵。因此，微生物培養技術的研究應該主要圍繞在這一方面，進行深入改進和發展，例如，可考慮將環境微生物用環境介質混合培養至生長穩定階段，然后將菌液離心過濾，用上清液作為培養基培養微生物，這些方法由于在培養過程中引入了多種微生物自然分泌的信號分子和促進復活因子，均可較好地強化微生物之間的相互關系，而克服引入單一信號分子的效果有限且操作費時費力的缺點。此外，在培養過程中結合多種培養因素、組合采取多種培養方案來取代模擬一種培養條件的方案，可以獲得更多可培養的微生物、取得更高效的培養結果。

　　三、培養微生物技術的改良措施

　　(一)減少毒性物質的毒害作用

　　由于常規培養方法使用的高濃度營養基質不利于微生物生長，適當降低營養基質的濃度可以減弱這種不利影響，研究發現低濃度基質的培養基培養出的細菌在數量和種類上均多于高濃度基質的培養基，但營養濃度過低時反而會使培養出的微生物數量下降。實際上，營養基質濃度最好與微生物自然生長環境相近，例如，輔以少量生長因子的天然海水或土壤浸提液作為培養基可以很好地培養海洋微生物和土壤微生物。另外，多聚物只有被水解為小分子物質時才能被微生物利用。以多聚物為碳源，能有效減緩毒性氧釋放的速度，避免微生物在短時間內受到高強度的毒性作用。同時，充足的氧氣有時也是毒性氧產生的原因之一，減少培養環境中的氧分壓可減弱毒性氧的影響。以上三種措施均可減少微生物代謝過程產生的毒性氧，但有些情況下，毒性氧來源于微生物生命活動以外的過程，例如高壓滅菌。

　　為了減少各種過程產生的毒性氧，可向培養過程中加入具有毒性氧降解能力的物質，例如過氧化氫酶、丙酮酸鈉等過氧化氫降解物和抗氧化劑二硫代二丙酸。已經證實這些物質可使某些處于VBNC狀態的細菌的可培養性得到不同程度的恢復。其中內酮酸鈉對微生物可培養性恢復的效果最好，只有其有穩定、成本低等優點。

　　(二)維持微生物間的相互作用

　　在培養基中加入微生物相互作用的信號分子就可簡單模擬微生物間的相互作用，滿足微生物生長繁殖的要求，例如加入酰基碳鏈長度各異的氦酰高絲氨酸內酯均能有效提高細菌的可培養性，而與革蘭氏陰性菌多種基因調控有關的另一種信號分子cAMP比氮酰高絲氨酸內酯能夠促使更多細菌得到培養。同源性分析結果表明Rpf存在于多種革蘭氏陽性菌中，推測原核生物可能廣泛存在該類物質，因此，可考慮加入同類型的Rpf來提高環境中微生物可培養性。

　　(三)其他改進措施

　　1.延長培養時間：對“寡營養菌”的培養，可適當延長培養時間，使其能長至肉眼可見的尺度。當然培養時間不能無限增長，因為培養時間越長，對培養環境的無菌要求就越高。

　　2.供應新型的電子供體和受體：不同微生物的代謝過程不同，因此對反應的底物要求也不盡相同。供應微生物需要的特有底物有助于新陳代謝反應的進行及微生物的正常生長。大量的研究表明，將新穎的電子供體和受體應用到微生物培養中，能夠發現未知的生理型微生物。

　　3.利用瓊脂替代物：瓊脂對某些微生物具有毒性作用，采用無害且凝結作用較好的替代物質作為培養基固化劑，可以增加微生物的可培養性。

　　4.分散微生物細胞：自然界中很多微生物聚集生長，形成“絮體”和“顆粒”等，致使其內部的微生物不易被培養。對“絮體”和“顆粒”進行適度的超聲處理，將細胞分散再進行培養，可以使更多的微生物接觸培養基而得到培養。

　　四、結語

　　總之，由于微生物群落及其生存環境的復雜性，在任何情況下試圖大量培養微生物都不能僅局限于一種或幾種方法，而應綜合采用多種有效的方法。另一方面，還應在發展微生物培養技術的同時，結合分子生物學技術，使兩種方法相輔相成，更好地提高微生物的可培養性。

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