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九香止瀉腸溶片對副溶血弧菌活性及小鼠小腸功能亢進模型的影響論
目的 探討九香止瀉腸溶片對副溶血弧菌活性以及對新斯的明所致的小鼠小腸功能亢進的影響。方法 采用瓊脂擴散法測定抑菌圈直徑，液體培基測定法與平皿傾注法測定最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）；給小鼠皮下注射甲硫酸新斯的明0.15 mg/kg造成小腸功能亢進造模，灌胃10％炭末生理鹽水，測定小腸推進率。結(jié)果 九香止瀉腸溶片在50 mg/mL濃度對副溶血弧菌表現(xiàn)出較強的抗菌作用，其作用優(yōu)于腸康片，MIC為50 mg/mL，MBC為500 mg/mL；與模型組比較，九香止瀉腸溶片各劑量組小腸推進率顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；其中高劑量組明顯優(yōu)于腸康組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論 九香止瀉腸溶片具有顯著的抗副溶血弧菌活性、抑制小腸功能亢進作用。〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ To investigate the effect of Jiuxiang Zhixie granule（JZG） on vibrio parahaemolyticus activity and the small intestinal hyperfunction induced by neostigmine in mice. Methods The diameter size of inhibition circle was measured with agar diffusions, and minimum inhibitory concentration(MIC) and minimum bactericidal concentration(MBC) were detected with fluid medium determination method; The model was induced by hypodermic injection 0.15 mg/kg of neostigmine methylsulfate, and the pushing rate of small intestine in mice was measured after intragastric infusion with 10％ Charcoal-powder saline. Results JZG in 50 mg/ml concentration was stronger to inhibit and kill vibrio parahaemolyticus, which was more effective than Changkang tablet. The MIC concentration was 50 mg/ml, the MBC concentration 500 mg/mL. Compared with the model group, the pushing rate of small intestine in each dosage of JZG group was lower obviously(P<0.05). The medium and high dosage groups were more effective than that in Changkang group(P<0.05). Conclusions JZG is very effective to inhibit activity of vibrio parahaemolyticus, and depress the propellent function of small intestine.
〔Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ〕 Jiuxiang Zhixie granule; marine vibrio; antisepsis; neostigmine; propellent function of small intestine; mice; Cortex Fraxini; cortex toonae 急性腹瀉的發(fā)病原因多為感染性腹瀉，細菌感染引起的腹瀉占感染性腹瀉多數(shù)。致瀉性海洋弧菌引起的急性腹瀉發(fā)病率呈上升趨勢，副溶血弧菌就是其中一種致瀉性海洋弧菌。九香止瀉腸溶片主治濕熱瀉泄，其臨床療效確切、安全。擬九香止瀉腸溶片對副溶血弧菌活性的影響及其對新斯的明引起的小鼠小腸功能亢進模型的影響進行研究�，F(xiàn)將實驗方法及結(jié)果報道如下。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 藥物 九香止瀉腸溶片干浸膏，由湖南中醫(yī)藥大學藥學院藥劑教研室提供，由秦皮、香椿皮等藥組成藥物濃度為每克浸膏含5 g生藥，批號：20050811，臨床推薦劑量為3 g生藥/次，3次/d，3 d為1個療程；腸康片，湖南湘泉制藥有限公司生產(chǎn)，批號：20050201；諾氟沙星膠囊，福建古田藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：060106-4；甲硫酸新斯的明注射液，上海信誼金朱藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：030501。
1.1.2 動物 昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由湖南農(nóng)業(yè)大學動物科技學院實驗動物養(yǎng)殖場提供。許可證號：SCXK(湘)2003-0003，均在日常條件下飼養(yǎng) 3 d后進行試驗。
1.1.3 菌種 副溶血弧菌由湖南省商品進出口檢驗檢疫局食品檢驗檢疫科提供，購自大連海事檢驗中心，批號：20050603。
1.1.4 試劑與儀器 瓊脂；NaCl；墨汁；無菌注射用水；生物顯微鏡；超凈工作臺；血球計數(shù)板；抗菌實驗用瓊脂打孔器（Φ6 mm）；柳葉刀；游標卡尺等。
1.2 方法
1.2.1 九香止瀉腸溶片對致瀉性海洋弧菌的檢測方法[1] （1）菌液制備 將副溶血弧菌菌種在3.5％NaCl肉湯瓊脂培養(yǎng)基中增菌，37 ℃培養(yǎng)，取對數(shù)生長的菌液。使用時用麥氏計數(shù)法，將菌液濃度調(diào)整為1×109個/mL。（2）抑菌實驗 采用瓊脂擴散法（打孔法）。制備我妻氏血瓊脂平板，無菌檢查后，進行抗菌實驗：取0.1 mL副溶血弧菌菌液（菌液濃度為1.5×109 cfu/mL）均勻涂布整個培養(yǎng)基表面，用直徑6 mm無菌打孔器在我妻氏血瓊脂平板的表面打孔，每個平板上打3孔，各孔中心相距約24 mm，每孔加入300 μL藥液（藥液濃度為1 g/mL），于37 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察抑菌圈的有無，用游標卡尺準確量取抑菌圈直徑，同樣操作重復9次，同時設諾氟沙星膠囊和腸康片對照孔。（3）藥物的MIC測定 ①采用液體培基測定法測定藥物的MIC。制備3.5% NaCl肉湯培養(yǎng)基：NaCl 3.5 g加入布氏肉湯培基100 mL中即得，加熱溶解，分裝于試管，每管1 mL，121 ℃、1.05 kg/cm2高壓滅菌15 min備用。②將九香止瀉腸溶片無菌干粉用注射用無菌用水溶解成1 g/mL，實驗用3.5% NaCl肉湯培養(yǎng)基將藥液進行對倍稀釋1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024，共10管。同時設含菌不加藥的菌液對照，加藥不加菌的藥物對照，培養(yǎng)基作對照。③每管加入0.05 mL副溶血弧菌菌液，置37 ℃、培養(yǎng)24 h，肉眼觀察，以能抑制細菌生長的最高藥物稀釋倍數(shù)即為最低抑菌濃度（MIC）。（4）藥物的MBC測定 取MIC以上無細菌生長的培養(yǎng)物0.1 mL，傾注于不含藥物的我妻氏血瓊脂培養(yǎng)基，待培基冷凝后，置37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察有無細菌生長，以無菌生長的濃度即為藥物的最低殺菌濃度（MBC）。
1.2.2 九香止瀉腸溶片對新斯的明所致的小鼠小腸功能亢進的實驗方法[2] （1）動物分組及給藥方法 取小鼠60只，雌雄各半，編號、稱體質(zhì)量后，按體質(zhì)量排序，性別、體質(zhì)量分層后按隨機數(shù)字表法隨機分為6組：空白對照組、模型組、腸康片組、九香止瀉腸溶片低、中、高劑量組（以下簡稱低、中、高劑量組），每組10只。九香止瀉腸溶片低、中、高劑量組分別以相當于臨床等效劑量1、3、9倍濃度（1.17 g/kg、3.51 g/kg、10.53 g/kg）灌胃給藥，腸康片組以相當于臨床等效劑量3倍濃度給藥（0.94 g/kg），小鼠灌胃體積為20 mL/kg，實驗前小鼠禁食不禁水24 h，實驗開始各治療組均按計算出的劑量分2次灌胃相應藥物給藥，給藥間隔4 h；空白對照組和模型組灌胃同體積蒸餾水；模型組與各治療組每只小鼠均皮下注射甲硫酸新斯的明0.15 mg/kg。15 min后，各組小鼠均灌胃10％炭末生理鹽水，體積為10 mL/kg，20 min后處死，測量每組小鼠小腸長度和炭末前端至幽門的推進距離，計算炭末在小腸的推進率。（2）檢測指標 小鼠小腸長度、炭末推進長度、計算小腸推進百分率。
P＝小腸炭末推進長度（cm）/小腸全長(cm)×100％。
百分率數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，以百分率的平方根的反正弦數(shù)值（Arcsin）為統(tǒng)計指標。
1.2.3 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。以均數(shù)±標準差表示（ｘ±ｓ）。
2 結(jié)果
2.1 九香止瀉腸溶片對致瀉性海洋弧菌活性的影響
2.1.1 抑菌實驗 結(jié)果顯示，九香止瀉腸溶片組抑菌圈直徑顯著大于腸康片組；九香止瀉腸溶片組、腸康片組抑菌圈直徑小于諾氟沙星膠囊組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)果見表1。
2.2.2 MIC及MBC測定 結(jié)果顯示，九香止瀉腸溶片干浸膏對副溶血弧菌的MIC為50 mg/mL，MBC為100 mg/mL，腸康片MIC為500 mg/mL，諾氟沙星膠囊MIC為5 μg/mL。九香止瀉腸溶片在一定濃度下對副溶血弧菌表現(xiàn)出了較強的抗菌作用。如圖1。
2.2 九香止瀉腸溶片對新斯的明所致的小鼠小腸功能亢進的影響
實驗結(jié)果顯示，模型組與空白對照組比較，小腸推進率明顯提高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；腸康片組、九香止瀉腸溶片低劑量組、中劑量組、高劑量組與模型組比較，小腸推進率明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；九香止瀉腸溶片中劑量組、高劑量組與腸康片組比較，小腸推進率明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；見表2。
3 討論
九香止瀉腸溶片主要由秦皮、香椿皮等組成的復方。秦皮苦、辛，平，具有清熱、解毒、止痢、明目等功效。主治泄瀉，痢疾，白帶，目赤等�，F(xiàn)代藥理研究證實，秦皮揮發(fā)油具有抗菌消炎、抗腫瘤的生物學活性。椿皮苦、澀、寒，具有清熱燥濕，收澀止帶，止瀉，止血，殺蟲之功效。臨床主要用于濕熱瀉痢，赤白帶下，久瀉久痢，腸風便血，崩漏帶下，外用可燥濕殺蟲止癢，治瘡癬[3]。香椿皮主要含川楝素、甾醇、鞣質(zhì)等。其主要成分為臭椿苦內(nèi)酯等，現(xiàn)代藥理研究證明，香椿煎劑可以抑制和殺滅金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌等[4]。本實驗結(jié)果提示，實驗平皿肉眼可見明顯的抑菌圈，九香止瀉腸溶片對副溶血弧菌的MIC是50 mg/mL；MBC是100 mg/mL，說明九香止瀉腸溶片對副溶血弧菌有明顯的抑菌作用。前期我們已經(jīng)做了九香止瀉腸溶片對痢疾桿菌、大腸桿菌等常見相關細菌的抑菌實驗，結(jié)果表明抑菌作用顯著，相關實驗將在其它論文發(fā)表。而細菌感染是引起急性腹瀉的主要病因。提示九香止瀉腸溶片可能通過抑制或殺滅致瀉性細菌從而達到止瀉之目的。
新斯的明具有抗膽堿酯酶作用，能可逆性的與膽堿酯酶結(jié)合，使內(nèi)源性乙酰膽堿（Ach）在體內(nèi)堆積，表現(xiàn)出Ach作用。因尚能直接作用于骨骼肌細胞的膽堿能受體，故對骨骼肌作用較強；縮瞳作用較弱。多用于重癥肌無力及腹部手術后的腸麻痹[5]。在本實驗中我們利用其作為腸功能亢進的造模藥物。實驗結(jié)果顯示，九香止瀉腸溶片低、中、高劑量組與新斯的明模型組比較，小腸推進率明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明九香止瀉腸溶片具有抑制新斯的明引起的腸功能亢進的作用。
近年來應用少數(shù)民族特色中草藥治療急性腹瀉的報道逐漸增多，其應用前景較為廣泛，因此，九香止瀉腸溶片是根據(jù)少數(shù)民族名老中醫(yī)應用多年的經(jīng)驗方而制成之制劑，臨床應用多年療效對比觀察，提示該藥對于濕熱瀉泄具有非常好的療效。前期動物毒性實驗研究提示其長期口服安全，無明顯毒副作用，推薦的臨床使用劑量基本安全，無毒副作用[6]。本實驗研究提示該藥具有良好的抗菌、消炎等作用，為應用于臨床提供了可靠的科學理論及實驗依據(jù)。
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