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宮頸癌多階段多途徑演進的樹模型構建論文
目的 基于宮頸癌比較基因組雜交資料構建宮頸癌的樹模型，探討宮頸癌發展演進的多途徑模式。 方法 根據收集的58例宮頸癌完整比較基因組雜交資料，利用Desper等建立的腫瘤樹模型軟件平臺，構建宮頸癌的樹模型。 結果 宮頸癌樹模型提示，有6個非隨機的染色體擴增或者缺失事件發生在宮頸癌變過程中：+1q，+3q，+5p，+17q，+20q和+20p，其中+3q和+1q可能是宮頸癌癌變中的重要早期事件；+3q要先于+17q發生，并且兩者之間可能存在先后依存關系；而且，+1q可能是一個相對獨立發生的事件；這些擴增染色體上可能存在與宮頸癌發生、發展演進密切相關的瘤基因。結論 基于比較基因組雜交資料構建的宮頸癌樹模型，提示宮頸癌多階段、多途徑的發展演進模式，也為后續宮頸癌相關基因的探索指明了方向。Abstract:Objective Based on CGH(comparative genomic hybridization, CGH) data, to construct tree model of cervical carcinoma and to explore multipathway model of cervical carcinoma progression. Methods Using the software which Desper et al developed, tree models of cervical carcinoma were constructed according to the CGH data of 58 cervical carcinoma patients. Results Tree models for cervical carcinoma suggested that there were +1q，+3q，+5p，+17q，+20q and +20p six nonrandom genetic events, and +1q and +3q might be important early events in cervical carcinogenesis, indicating that there might be cancer?related genes in these chromosomal arms. As changes of +3q occurred prior to those of +17q, there might be some cause?effect relationship. The changes of +1q might be a independent genetic event. Conclusion Tree models based on CGH data of cervical carcinoma imply its’ multistep and multipathway progression and direct how to searching for cervical cancer?related genes.
Key words:cervical carcinoma; comparative genomic hybridization;tree model
腫瘤的發生發展是基因改變不斷發生、不斷累積的結果。那么，在腫瘤發生發展過程中，基因改變的模式如何呢？1988年，Vogelstein等［1］首次提出了結直腸癌演進的經典模型，即結直腸癌的演進由4個遺傳事件以鏈式模式發展的，即路徑模型：染色體5q上APC基因的缺失或突變；12p上K?ras基因的突變；18q上DCC基因的缺失；17p上p53基因的缺失或突變。第一個事件的發生能增加第二個事件發生的概率，第二個事件的發生能增加第三個事件發生的概率，依次類推。這些基因改變一旦發生，就是一個不可逆的發展演進過程。腫瘤演進的經典路徑模型對于確定腫瘤早期診斷或治療的相關基因位點具有重要價值。于是，人們試圖在其他腫瘤的演進過程中找到與結直腸癌類似的路徑模型，但是，都沒有成功［2］。事實上，在腫瘤的發展演進過程中，遺傳物質的改變不會總是按照一定的順序、沿著一條路徑發生，而且，即使在臨床上或者病理學上認為同質的腫瘤，其本身存在異質性［3］。因此，探索不依賴于單純線性演進的腫瘤發展模型是很有必要的。Desper等［4,5］提出了反應腫瘤異質性的腫瘤發生發展的兩種進化樹模型，即分枝樹和距離樹。為此，本研究利用Desper等基于比較基因組雜交（comparative genomic hybridization,CGH）資料建立的樹模型軟件并加以改進，對58例宮頸癌患者（其中包括4種宮頸癌細胞株）的CGH資料進行了分析，構建了宮頸癌發展演進的樹模型。
1 材料與方法
1.1 材料
收集了58例宮頸癌完整CGH檢測資料，其中FIGO分期Ⅰ期21例，Ⅱ期14例，Ⅲ期16例，Ⅳ期3例，還有4種宮頸癌細胞株的CGH資料［6-9］。
1.2 事件的選擇
CGH檢測的結果是一個關于染色體拷貝數量改變（copy number aberrations,CNAs）的遺傳事件集。本文利用最常用的Brodeur法［10］選擇一組非隨機事件，Brodeur法假設擴增和丟失的機會均等，并與染色體臂長成正比［11］。構建樹模型的數據是一系列的染色體擴增和丟失，一例病人對應一行數據，記錄的是染色體臂水平擴增和丟失。人類有22對常染色體和X、Y兩條性染色體，所有染色體都有長臂q，而13、14、15、21、22號染色體短臂p很短，本文排除了這5個染色體短臂，還忽略了1p、16p、19p、19q和22q這5個染色體臂，因為這些區域富含胞嘧啶和鳥嘌呤，易出現假陽性；另外，還忽略了Y染色體，因為其短且很少改變。這樣就剩下36條染色體臂需要分析，而每條染色體臂都有可能擴增或丟失，因此，總共有72個可能事件。
1.3 樹模型
1.3.1 分枝樹（branching trees）
Desper等人［4］利用基于計算機技術的最大權重分枝方法提出的一種重構腫瘤發生發展的樹模型方法，并稱這種樹模型為分枝樹。該模型把一個節點作為根（root），而其他的每個節點都代表一個遺傳事件。在一個樹枝上，i>j表示一種假說的因果關系，即事件i的出現使得事件j的發生更為可能。分枝樹實際上是Vogelstein路徑模型的泛化，也就是將腫瘤發生的一條路徑模型轉化為多條路徑模型（multiple pathways），一個樹干即為一條路徑，更直觀地體現了腫瘤的異質性。分枝樹提示：（1）靠近樹根的事件可能是早期事件，也可能是因為與其他事件的發生相關性不大而置于近根部；（2）在一個樹枝（edge）上按順序走向的事件有可能存在因果關系；（3）集聚在樹的分枝（subtree）下的事件可以作為腫瘤亞型（subclass）的標志。
1.3.2 距離樹（distance?based trees）
Desper等人［5］利用現有的系統發育算法建立另一種樹模型。該模型把所有的事件都作為葉子，同時把隱含的、未命名的事件作為內在節點。該模型的另一個不同點是，樹中的每一個樹枝都有長度，因此，基于這種方法建立的樹模型被稱作距離樹。從根到其他事件i的距離為?log (pi), 其中pi是事件i的觀察概率，可見，事件i的觀察概率越大，它離樹根的距離越近，即越早發生。距離樹提示：（1）靠近根的事件是早期事件；（2）集聚在樹的分枝（subtree）下的事件可以作為腫瘤的亞型（subclass）標志。
1.4 統計學分析
用SPSS10.0 for windows統計軟件包進行χ2檢驗， 當n<40 或頻數<1 時，用確切概率法。
2 結 果
2.1 宮頸癌發展演進樹模型的構建
宮頸癌樹模型見圖1。從分枝樹模型可以看出，+1q和+3q可能是宮頸癌癌變較早期事件，+1q是相對較獨立的事件，+3q的出現可能導致+17q的發生，而+17q的發生又將促進+20q的發生，+20q的發生必將增加+5p、+20p出現的概率。從距離樹可以清楚地得出+3q是宮頸癌發生發展過程中較重要的早期事件。
2.2 宮頸癌中非隨機染色體事件的統計分析
58例宮頸癌（其中4個細胞株）樣本中，+1q，+3q，+5p，+17q，+20q和+20p分布見表2，各染色體臂改變的頻率如下：+1q為36.2%；+3q為70.7%；+5p為20.0%；+17q為24.1%；+20q為15.5%；+20p為15.5%。表1 宮頸癌6個非隨機染色體事件分布情況（略）
2.3 根據宮頸癌樹模型可以看出，宮頸癌可能存在2種亞型：一種以+3q、+5p、+17q、+20p和+20q為標記，一種以+1q為標記；宮頸癌染色體改變以擴增為主。
3 討 論
自從1988年Vogelstein 等［1］提出結直腸癌發生、發展、演進的經典路徑模型，科學研究者們希望其他腫瘤的發展演進也有與結直腸癌相似的經典路徑模式，但是都沒有取得理想的結果。原因是腫瘤是一個多因素參與、多基因改變、多步驟發展的復雜過程，腫瘤具有異質性。
比較基因組雜交技術可以在染色體或染色體亞區水平上對DNA序列拷貝數進行檢測、定位。它最大的優點是一次雜交就可以全面檢測出腫瘤基因組復雜的遺傳改變，包括染色體區段拷貝數的增加或減少。為了深入挖掘從大量標本獲得的海量CGH資料中蘊含的關于腫瘤發生、發展、演進的規律，Desper等根據數學原理結合計算機技術開發出了一種CGH資料數據分析軟件，即根據CGH資料數據構建腫瘤發生、發展、演進的2種樹模型：分枝樹和距離數。他們利用CGH資料數據分析軟件分析了116例腎透明細胞癌的CGH資料，并構建了腎透明細胞癌的2種樹模型，結果分析與以前細胞遺傳學研究的結果相吻合，如3p丟失是腎透明細胞癌發生的早期事件，根據樹模型還提出了腎透明細胞癌發生發展過程中有意義的新假說［12］。這有力地說明構建基于CGH資料的腫瘤樹模型對于研究腫瘤發生發展及其演進規律是非常有意義的。
尹志華［13］等利用CGH資料數據分析軟件分析了收集到的127例結直腸癌的CGH資料，構建了結直腸癌發生發展的樹模型，結果顯示，樹模型與Vogelstein的經典路徑模型有一定的吻合度，如-18q先于-17p發生，而且使后者的發生可能性更大。兩者差別也是明顯的，與經典路徑模型相比，樹模型更體現了腫瘤的異質性及腫瘤發生發展的多途徑模式，更符合現代關于腫瘤發生發展演進的理論，經典路徑模型顯得過于簡單。
本研究利用CGH資料數據分析軟件分析了58例宮頸癌CGH資料，構建了宮頸癌發生發展的樹模型，模型各染色體臂改變的頻率如下：+1q為36.2%；+3q為70.7%；+5p為20.0%；+17q為24.1%；+20q為15.5%；+20p為15.5%。Lazo等［14］研究發現，90%的浸潤宮頸癌中發現有3q的擴增。Wilting等［15］研究發現，在宮頸鱗狀細胞癌和宮頸腺癌中常見20q拷貝數的擴增。樹模型提示，+1q和+3q可能是宮頸癌癌變較早期事件，統計分析結果也證明了這一點，+1q 、+3q和+17q在宮頸癌的發展演進過程的各個階段中差異沒有顯著性（P＞0.05）。
Andersson等［16］研究發現，宮頸腺癌中，3q26上人端粒酶基因TERC常見擴增，并可作為宮頸腺癌的診斷指標。+5p和+20p在宮頸癌早期和進展期中，差異有顯著性（P＜0.05），進展期高于早期，說明+5p和+20p 是宮頸癌發展演進的晚期事件，+20q 在宮頸癌發展演進中的確切作用有待擴大樣本進一步確定。根據樹模型可以推測，宮頸癌可能存在2種亞型：一種以+3q、+5p、+17q、+20p和+20q為標記，一種以+1q為標記；宮頸癌染色體改變以擴增為主。
總之，利用CGH資料數據分析軟件構建基于CGH資料的腫瘤發生發展的樹模型，對于挖掘蘊含在海量數據中的腫瘤發生發展演進規律具有重要意義。本研究提示+1q 、+3q、 +5p、+17q、+20p和+20q是宮頸癌發生發展演進過程中的非隨機事件，提示在這些染色體臂上可能存在與宮頸癌發生發展密切相關的腫瘤基因，為后續相關研究指明了方向。
由于CGH技術存在敏感性低的缺點，小于10 Mb的染色體改變檢測不出［17］ ，一些染色體缺失11q23，2p, 3p, 18q21.3 和11p15.5等未出現在樹模型中［18，19］。 但是，一次實驗就能給出了一個腫瘤全基因組水平的遺傳改變的全貌。基于CGH資料和數學模擬建立的腫瘤發生發展的進化樹模型，科學地闡明了腫瘤發生發展的多基因、多步驟的演進過程，體現了腫瘤內在的異質性。深入分析宮頸癌進化樹模型中的6個非隨機染色體事件，對于發現與宮頸癌發生發展密切相關的腫瘤相關基因，闡明宮頸癌發病的分子機制等具有重要指導意義。
致謝：衷心感謝美國國立健康研究所（NIH）的Desper R和Schaffer A為本分析CGH資料所提供的熱情幫助。
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