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青紫薯色素安全性評價
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【摘要】目的 對青紫薯色素安全性進行評價。方法 采用最大給藥量試驗，小鼠每天3次、每次36 mL/kg灌胃給予200 g/L的青紫薯色素水溶液14 d，觀察其體質量變化和死亡情況;以倉鼠肺成纖維細胞(CHL)行染色體畸變試驗，對青紫薯色素進行毒理學評價。結果 小鼠灌胃給予21.6 g/(kg·d) 青紫薯色素后未出現毒性反應，也無動物死亡，體質量增長良好;CHL染色體畸變試驗呈陰性，染色體畸變率在正常范圍內。結論 青紫薯色素灌胃給藥21.6 g/(kg·d)未出現急性毒性反應，青紫薯色素在1.00 g/L劑量下無致突變作用。
【關鍵詞】 色素類 甘薯 急性毒性試驗 染色體畸變
甘薯是一種耐寒、耐貧瘠、適應性廣、污染少、易栽培的糧食作物[1]。國內外研究結果顯示，甘薯具有抗氧化、抗突變、抗腫瘤、增強記憶等多種生理功能[2～4]。青紫心甘薯是紫甘薯的改良品種，青紫薯色素由青紫心甘薯采用酸性溶劑萃取法制備而來。青紫薯色素是一種含原花青素的物質，研究證實，它可以抑制氧化應激對組織細胞的損傷，可有效清除超氧陰離子自由基、羥基自由基、過氧化亞硝基自由基和脂類自由基，保護小鼠抗60Co γ?射線輻射所致的氧化損傷，減少氧自由基的產生，抑制脂質過氧化，抑制腫瘤細胞形成等[5,6]。同時，還具有抗Fe2+引發的卵磷脂脂質體過氧化、抑制H2O2引發的紅細胞溶血作用的能力[7]。本研究應用最大給藥量試驗及中國倉鼠肺成纖維細胞(CHL)染色體畸變試驗，對青紫薯色素進行安全性評價，為拓寬甘薯應用領域及開發系列產品提供基礎實驗依據。
1 材料與方法
1.1 材料
青紫薯色素凍干粉，由青島市農技站提供，批號為20031129?2，溶于水，配制成200 g/L青紫薯色素水溶液。選擇昆明種小鼠60只，由河南省實驗動物中心提供，雌雄各半，體質量為21～23 g。CHL細胞為置于-80 ℃或液氮凍存樣品。絲裂霉素C(MMC)、環磷酰胺(CTX)，山西泰盛制藥有限公司生產。肝微粒體酶(S9) 按常規方法制備。
1.2 方法
1.2.1 最大給藥量試驗[8] 經預試驗后，選健康小鼠40只，體質量21～23 g，雌雄各半。隨機分為生理鹽水對照組和青紫薯色素組。禁食2 h后，青紫薯色素組小鼠灌胃給予200 g/L青紫薯色素水溶液，每次36 mL/kg，每天3次，間隔6 h，共21.6 g/(kg·d);空白對照組給予等量生理鹽水。兩組均連續給藥14 d，觀察小鼠的活動狀態、飲食情況、糞便、呼吸，記錄體質量變化及死亡情況。
1.2.2 染色體畸變試驗 以CHL細胞進行加與不加S9 的染色體畸變試驗。陽性對照為不加S9的MMC (0.1 mg/L),加S9的CTX(20 mg/L)。設青紫薯色素1.00、0.50、0.25 g/L等3個劑量組，以生理鹽水作為陰性對照組。每個測試組采用2個平行培養瓶。將5 ×104個CHL細胞接種于50 mL培養瓶中,培養72 h后,加入受試物。不加S9時, 受試物與細胞作用24 h及48 h后,分別收獲細胞制片。而加S9時,受試物、S9混合液與細胞共同作用6 h后,將液體棄去,用PBS洗滌細胞3次,加入新培養液繼續培養24 h后,收獲細胞制片。常規制片, GIEMA染色。每一試驗組每瓶選擇100個分散良好的中期分裂相,在油鏡下觀察染色體有無斷裂、缺失、易位、互換、環、多倍體等染色體畸變。
1.3 統計學處理
結果用±s表示，用SPSS統計軟件對數據進行處理，數據間比較采用t檢驗。
2 結果
2.1 最大給藥量試驗
小鼠灌服藥物14 d內,青紫薯色素組未出現毒性反應,體質量增加，與生理鹽水對照組相比，差異無顯著性(P>0.05)，見表1。其外觀、行為活動、精神狀態、飲食、大小便及呼吸等均正常，無動物死亡。
表1 青紫薯色素灌胃給藥對小鼠體質量的影響(略)
2.2 染色體畸變情況
不加S9青紫薯色素各劑量組CHL 細胞染色體的畸變率為1%～3%，其畸變類型為斷裂和缺失，無明顯濃度依賴性;陰性對照組染色體畸變率2%，畸變類型為微小體和斷裂;而陽性對照組(MMC0.1 mg/L)染色體畸變率26%，畸變類型以斷裂、斷片、缺失、微小體為主。
加S9青紫薯色素各劑量組CHL 細胞染色體畸變率均為2%，畸變類型有斷裂、缺失、微小體;陰性對照組染色體畸變率1%，畸變類型為交換;陽性對照組(CTX 20 mg/L)的畸變率為27%，畸變類型以斷裂、斷片、微小體為主。
無論是加S9組還是不加S9組，24 h還是48 h收獲細胞，不同劑量青紫薯色素組畸變率均<5%，根據CHL細胞染色體畸變結果判定標準，畸變率在正常范圍內，為陰性;陽性對照組畸變率>20%，為強陽性。
3 討論
急性毒性試驗是毒理學研究的第一步，急性毒性研究方法很多，常用的有半數致死量和最大給藥量試驗。當受試物的毒性很低，或者因濃度或體積的限制，無法測出LD50時，可僅提供最大給藥量試驗的結果，以對藥物安全性進行評估[8]。
本文在預試驗中，因受藥物濃度和小鼠胃納量限制無法測出LD50，所以進行多次最大給藥量試驗。正式試驗結果表明，青紫薯色素組每天3次灌胃給予小鼠青紫薯色素14 d，對動物的體質量增長、進食情況、行為活動均無明顯影響，未發現因青紫薯色素蓄積而對動物產生毒性反應。小鼠灌胃給予青紫薯色素21.6 g/(kg·d)，最大耐受劑量(MTD) 大于21 600 mg/kg ,按1977年頒布的化學物質急性毒性分級標準，尤其是我國對職業性化學毒物危害程度的分級標準——中華人民共和國國家標準(GB5044?85)，LD>5 000 mg/kg，為實際無毒物。由此確定青紫薯色素為實際無毒物。
化學物的致突變作用一般通過致突變試驗來篩檢[9]。CHL細胞染色體畸變試驗是廣泛使用的遺傳毒理學試驗之一。可直接從染色體水平上反映遺傳物質的損傷情況，染色體是遺傳單位基因的載體，具有獨特的形態和結構，當受到外界誘變劑作用時出現損傷，形態及結構上就會發生畸變。染色體畸變涉及的遺傳物質改變的范圍比較大，一般可通過在光學顯微鏡下觀察細胞有絲分裂中期相，計算畸變率來檢測。
本文CHL染色體畸變試驗應用誘導劑處理后的S9進行體外代謝活化試驗，即在加S9mix和不加S9mix平行的條件下測試。觀察的畸變類型有：斷裂、斷片、缺失、微小體、著絲點環、無著絲點環及各種輻射體等。試驗結果顯示，直接誘變劑MMC(0.1 mg/L)組細胞染色體畸變率為26%，間接誘變劑CTX(20 mg/L)在S9活化條件下的畸變率為27%，均為強陽性，畸變類型主要有斷裂、斷片、缺失、微小體等。在S9活化和非活化兩種測試條件下，青紫薯色素在0.25～1.00 g/L濃度范圍內，其誘發CHL細胞染色體畸變率<5%，在正常范圍，說明對CHL 細胞染色體無損傷作用，即在本試驗條件下無致突變作用。
綜上所述，青紫薯色素最大給藥量為21.6 g/(kg·d)，為實際無毒物。在0.25～1.00 g/L劑量范圍內未見誘發CHL細胞染色體畸變率增高，無致突變作用。
【參考文獻】
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[4]CHO J, KANG J S, LONG P H, et al. Antioxidant and memory enhancing effects of purple sweet potato anthocyanin and cordyceps mushroom extract[J]. Arch Pharm Res, 2003,26(10):821?825.
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[9]王心如. 毒理學基礎[M]. 第4 版.北京:人民衛生出版社,2003：136
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