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金納多合阿米洛利對大鼠肝纖維化模型的干預(yù)作用論文
【摘要】 目的 觀察銀杏葉提取物金納多合阿米洛利對大鼠肝纖維化模型的干預(yù)作用。方法 以二甲基亞硝胺造成大鼠肝纖維化模型，分別觀察金納多與阿米洛利干預(yù)后，羥脯氨酸、透明質(zhì)酸及層粘連蛋白含量的變化。結(jié)果 各給藥組（除阿米洛利組外）大鼠肝功能均較模型組有明顯改善；阿米洛利和金納多給藥組較模型組的血清透明質(zhì)酸、層粘連蛋白和肝組織羥脯氨酸含量降低(P<0.05)；肝組織內(nèi)SOD較模型組升高，而MDA低于模型組(P<0.01)；金阿合用組效果最佳。結(jié)論 金納多(銀杏葉提取物)與阿米洛利對二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型均有預(yù)防作用，兩者合用有一定的協(xié)同作用。目前認為，肝纖維化可以預(yù)防和逆轉(zhuǎn)。近年來，已有不少學(xué)者以干擾肝纖維化形成過程中某一因素來干擾肝纖維化的發(fā)展，取得了一定成績。由于肝臟纖維化的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的過程，有諸多因素參與，因此僅干擾其中某一因素效果并不理想。新近關(guān)于肝纖維化形成機制的研究表明氧應(yīng)激和交換泵在肝纖維化形成中起重要作用[1,2]，為抗肝纖維化的研究提供了新靶點。本實驗通過建立二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的肝纖維化模型，觀察聯(lián)用Na+/H+交換泵抑制劑阿米洛利（Amiloride）與抗氧化劑銀杏葉提取物金納多[3]（Ginaton）聯(lián)用對大鼠纖維化形成的影響，以探索臨床抗肝纖維化的新途徑。現(xiàn)將實驗方法及結(jié)果報道如下。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 動物 雄性SD大鼠，體質(zhì)量（180±30）g，購于湖南中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，合格證號：SCXK（湘2002-003）。
1.1.2 藥物 阿米洛利，1 g/瓶，購自Sigma公司；金納多(銀杏葉提取物)，5 g/瓶，由德國威瑪舒培大藥廠生產(chǎn)；二甲基亞硝胺，100 mL/瓶，購于TCI公司。
1.1.3 儀器 752-紫外分光光度計上海第三分析儀器廠，LD5-2A離心機北京儀器廠，AA-160型電子天平德國Denver公司，SN-862型放射免疫γ計數(shù)器上海分析儀器廠。
1.1.4 試劑 超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒為南京建成生物制品公司產(chǎn)品；透明質(zhì)酸（HA）和層粘連蛋白(LN)放免試劑盒購自上海海軍生物醫(yī)學(xué)研究所。
1.2 方法
1.2.1 動物分組與造模 模型建立參照文獻[4]。雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量150～210 g，隨機分為6組，即正常組、模型組、阿米洛利組、金納多組、金納多+阿米洛利組（簡稱金阿合用組）、馬絡(luò)替酯組，每組10只。其中模型組及給藥組每周連續(xù)3 d腹腔注射二甲基亞硝胺10 mg/kg,共3周；各給藥組造模同時每日分別經(jīng)胃灌注阿米洛利(1 mg/kg)、金納多(40 mg/kg)、金阿合用組（與單用組濃度相同），共用藥3周；馬絡(luò)替酯組造模同時每日經(jīng)灌胃馬洛替酯[5]（90 mg/kg）；正常對照組每周連續(xù)3 d腹腔注射生理鹽水，共3周，同時每日灌胃生理鹽水共3周。第4周初，摘眼球采血后處死動物，剪下完整肝臟組織標(biāo)本，稱肝質(zhì)量后取部分中葉肝臟以10%中性甲醛固定，3 d內(nèi)石蠟包埋，備病理檢測；將余下肝臟于液氮中速凍，備肝組織勻漿測組織MDA、SOV、羥脯氨酸、透明質(zhì)酸及層粘連蛋白，血清于-70 °C冰箱內(nèi)保存?zhèn)涓喂δ軝z測。
1.2.2 肝功能、脂質(zhì)過氧化指標(biāo)檢測 MDA、GSH-PX、 SOD HA及LN均按試劑盒說明測定。肝組織羥脯氨酸測定參照李文才等[6]的方法。
1.3 統(tǒng)計學(xué)分析
計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ｘ±ｓ)表示， 用統(tǒng)計軟件SPSS10.0進行單因素變量的方差分析和最小差值顯著法（LSD）的兩兩比較。
2 結(jié)果
2.1 一般情況
正常對照組大鼠一般狀態(tài)良好；模型組活動少，皮毛欠光滑，尿色黃，有腹瀉。各給藥組大鼠精神活躍，毛發(fā)光滑，體型豐滿，無腹瀉。
2.2 肝功能指標(biāo)檢測
如表1所示：與正常組比較，模型組谷丙轉(zhuǎn)胺酶（ALT）和堿性磷酸酶（AlP）的水平明顯升高，白蛋白、球蛋白比（A/G）的水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；除了阿米洛利組外，其它給藥組ALT和AlP顯著低于模型組，而A/G顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；對ALT和A/G的影響金阿合用組優(yōu)于阿米洛利單用組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；對AlP的影響合用組優(yōu)于兩單用組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見表1。
2.3 脂質(zhì)過氧化指標(biāo)
由表2可見：與正常組比較，模型組MDA的水平明顯升高，而SOD的活力明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，給藥組不同程度明顯扭轉(zhuǎn)MDA和SOD，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；對MDA的影響金阿合用組優(yōu)于各單用組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），對SOD的影響金阿合用組優(yōu)于金納多單用組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但不優(yōu)于阿米洛利單用組。見表2。
2.4 對大鼠肝纖維化程度的影響
由表3可見：與正常組比較，模型組HA、LN和 HYP的含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；各給藥組不同程度明顯降低HA、LN和HYP的含量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；對HA和LN的影響，金阿合用組優(yōu)于各單用組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；對HYP的影響，金阿合用組并不優(yōu)于單用組。見表3。
3 討論
本實驗的研究表明， 阿米洛利與金納多對二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的肝纖維化具有明顯的預(yù)防作用。肝功能檢測提示金納多可減輕肝細胞的變性和壞死，并改善肝細胞功能，1 mg/kg的阿米洛利無此功效，表現(xiàn)為除了阿米洛利組，其余各組谷丙轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶較模型組顯著降低(P<0.001)，白蛋白、球蛋白比顯著升高(P<0.001)。膠原纖維主要由膠原蛋白所構(gòu)成，Hyp為膠原蛋白所特有的氨基酸成分，其在肝臟中的含量可反映膠原代謝的變化情況，與肝纖維化程度相平行。本研究通過檢測肝組織勻漿Hyp的含量發(fā)現(xiàn)，金納多與阿米洛利均可降低Hyp的含量，說明阿米洛利與金納多均可抑制膠原的生成和沉積。氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化是引起肝細胞損傷與肝星狀細胞活化的重要機制[7]。通過檢測肝組織勻漿中SOD、MDA含量發(fā)現(xiàn)，各給藥組的SOD較模型組顯著升高，而MDA顯著降低，說明金納多有直接降低自由基生成，減輕脂質(zhì)過氧化的作用。而阿米洛利可能是通過抑制肝星狀細胞激活、增殖及轉(zhuǎn)型，從而減輕脂質(zhì)過氧化的作用。對SOD、MDA的影響，合用組優(yōu)于單用組，說明兩者在抗脂質(zhì)過氧化方面可能有協(xié)同效應(yīng)。肝星狀細胞活化為類肌成細胞，大量合成和分泌細胞外基質(zhì)是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)。本研究通過檢測HA和LN的水平發(fā)現(xiàn)，金納多與阿米洛利均可降低HA和LN的水平，尤以合用組最低，說明金納多與阿米洛利可以抑制肝星狀細胞活化，抑制細胞外基質(zhì)的合成和分泌。總之，金納多保護肝細胞及抑制肝星狀細活化的作用與阿米洛利抑制肝星狀細胞活化的作用可能正是它們合用效果更佳的原因。
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